转录组测序和差异基因分析
鉴定前列腺癌中差异表达基因，寻找关键调控因子
对正常小鼠和PCa模型小鼠前列腺组织进行RNA-seq，筛选出520个差异表达基因，与GeneCards PCa相关基因取交集得到94个PCa-DEGs，进行GO和KEGG富集分析。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
HIC1在前列腺癌进展和治疗反应中的新兴作用：一个新的视角。
Emerging role of HIC1 in prostate cancer progression and therapeutic response: A novel perspective.
实验完整度
高包含体外细胞实验（功能验证、机制验证）、体内小鼠异种移植瘤模型（生长和去势抵抗）及转录组测序，多个独立证据层级。
主要模型
LNCaP和VCaP人前列腺癌细胞系 LNCaP-AI去势抵抗性前列腺癌细胞系 小鼠前列腺原位异种移植瘤模型（BALB/c裸鼠） RM-1小鼠前列腺癌细胞系
重点核对
LNCaP和VCaP细胞中HIC1敲低和过表达的稳定转染 NT157浓度5 μM处理6小时抑制IRS2 EPI-7170每日口服30 mg/kg，NT157每周腹腔注射50 mg/kg 去势处理在肿瘤体积约300 mm3时进行 PSA水平每周检测
摘要
前列腺癌（PCa）是男性癌症相关死亡的主要原因，其进展和治疗反应复杂。本研究聚焦于HIC1（癌症中高甲基化1）在PCa中的作用，揭示其在PCa组织中的表达较正常组织下调。通过转录组测序和生物信息学分析，发现HIC1影响PCa中的关键细胞过程，如细胞生长、增殖、侵袭和雄激素受体（AR）信号传导。具体而言，AR被确定为胰岛素受体底物2（IRS2）的转录因子，IRS2激活PI3K/AKT通路，增强PCa细胞增殖和侵袭。然而，这种效应可通过使用NT157抑制IRS2而逆转。此外，HIC1过表达降低了PCa细胞的去势抵抗性，体内研究表明，HIC1沉默增加了PCa异种移植瘤的生长和耐药性，并升高了Ki-67、Cleaved-caspase-3、EMT标志物和前列腺特异性抗原（PSA）水平。相反，AR和IRS2抑制剂如EPI-7170和NT157对PCa进展有负面影响。这些结果强调了HIC1作为PCa治疗靶点的潜力，为其在癌症生物学和治疗中的作用提供了新的见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- HIC1在前列腺癌进展和去势抵抗中的作用及其潜在机制是什么？
- 核心机制
- HIC1抑制AR表达，AR作为IRS2的转录因子，激活PI3K/AKT通路，促进PCa进展和去势抵抗。
- 主要证据
- 体外细胞实验显示HIC1敲低促进增殖、侵袭和干细胞性，HIC1过表达抑制这些过程；双荧光素酶和ChIP验证AR结合IRS2启动子；体内裸鼠原位模型证实HIC1沉默增加肿瘤生长和去势抵抗，EPI-7170和NT157逆转这些效应。
- 研究意义
- HIC1可作为前列腺癌的生物标志物和治疗靶点，为去势抵抗性前列腺癌的治疗提供新策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细胞功能实验验证HIC1作用
验证HIC1对PCa细胞增殖、侵袭、干细胞性的影响
在LNCaP和VCaP细胞中敲低或过表达HIC1，通过CCK-8、EdU、克隆形成、Transwell和成球实验检测细胞功能，并用Western blot检测EMT标志物。
机制验证：AR/IRS2/PI3K/AKT轴
验证HIC1通过AR/IRS2/PI3K/AKT通路调控PCa进展
检测HIC1与AR表达负相关；通过双荧光素酶和ChIP验证AR结合IRS2启动子；用NT157抑制IRS2，LY294002抑制PI3K，SC79激活AKT，观察对细胞功能的影响。
去势抵抗细胞模型实验
评估HIC1对去势抵抗性前列腺癌细胞恶性行为的影响
建立LNCaP-AI细胞模型，过表达HIC1，检测AR、PSA表达，并通过CCK-8、EdU、克隆形成、成球和Transwell实验评估细胞行为。
体内动物模型验证
验证HIC1在体内对肿瘤生长和去势抵抗的影响
将LNCaP-sh-NC或LNCaP-sh-HIC1细胞原位植入裸鼠前列腺，进行去势及药物处理（EPI-7170、NT157），监测肿瘤生长、PSA水平、体重及组织中相关蛋白表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| RNA提取 | Trizol试剂 | Thermo | 16096020 |
| RNA质量检测 | Qubit®2.0荧光计 | Life Technologies | Q33216 |
| RNA Nano 6000分析试剂盒 | Agilent | 5067-1511 | |
| Qubit® RNA分析试剂盒 | Shanghai Baoji Biotechnology Co. | HKR2106-01 | |
| cDNA文库构建 | NEBNext® UltraTM RNA文库制备试剂盒 | NEB | E7435L |
| 测序簇生成 | TruSeq PE簇生成试剂盒v3 cBot HS | Illumina | PE-401-3001 |
| 测序 | Illumina HiSeq 550测序平台 | Illumina | -- |
| 细胞培养 | 恒温培养箱 | ThermoFisher | 51032874 |
| 胎牛血清 | Gibco | 10099 | |
| DMEM/F-12培养基 | Gibco | 21041025 | |
| DMEM培养基 | Gibco | 10566016 | |
| Ham's F-12K培养基 | Gibco | 21127022 | |
| RPMI 1640培养基 | Gibco | 11875093 | |
| 活性炭剥离血清 | Gibco | 12676-029 | |
| 慢病毒包装 | 慢病毒包装试剂盒 | Invitrogen | A35684CN |
| 慢病毒感染 | 聚凝胺 | Merck | TR-1003 |
| 稳定转染筛选 | 嘌呤霉素 | Sigma-Aldrich | 540222 |
| 药物处理 | NT157 | Beijing Bai'aolei Biotechnology Co., Ltd | M00819 |
| 2-羟丙基-β-环糊精 | Sigma | C0926 | |
| 恩杂鲁胺 | MedChemExpress | MDV3100 | |
| LY294002 | Abcam | ab120243 | |
| SC79 | MedChemExpress | HY-18749 | |
| 双荧光素酶检测 | pmirGLO载体 | -- | -- |
| Biovision荧光素酶检测试剂盒 | Biovision | K801-200 | |
| Promega双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | E1910 | |
| ChIP | 抗AR抗体 | Abcam | ab108341 |
| 抗IgG抗体 | Abcam | ab172730 | |
| Co-IP | Pierce™免疫共沉淀试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 26149 |
| RT-qPCR | cDNA第一链合成试剂盒 | Shanghai Beyotime | D7168L |
| RT-qPCR试剂盒 | Vazyme Biotech | Q511-02 | |
| Bio-rad CFX96实时荧光定量PCR仪 | Bio-rad | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013B |
| BCA蛋白浓度测定试剂盒 | Beyotime | P0011 | |
| PVDF膜 | BIO-RAD | 1620177 | |
| HRP标记的山羊抗兔IgG | Abcam | ab6721 | |
| HRP标记的山羊抗小鼠IgG | Abcam | ab6789 | |
| ECL反应液 | Bio-Rad | 1705062 | |
| Western blot成像 | Image Quant LAS 4000C凝胶成像系统 | GE | -- |
| CCK-8 | CCK-8试剂盒 | Beyotime | C0041 |
| EdU实验 | EdU | Guangzhou Ruibo Biotechnology Co., Ltd. | C10310-1 |
| DAPI | Biyun Tian Biotechnology Co., Ltd. | C1002 | |
| Transwell侵袭实验 | Transwell小室 | Corning | -- |
| 肿瘤球形成实验 | Complete MammoCult™人类培养基 | -- | -- |
| 小鼠实验 | D-荧光素 | -- | 150 mg/kg |
| EPI-7170 | MedChemExpress | 150102 | |
| ELISA | PSA ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-M0961c |
| 免疫组化 | 小鼠抗HIC1抗体 | Santa Cruz | sc271499 |
| 兔抗Ki67抗体 | Abcam | ab16667 | |
| 兔抗Cleaved caspase-3抗体 | CST | 9661 | |
| 兔抗前列腺特异性抗原抗体 | Abcam | ab76113 | |
| DAB显色试剂盒 | Beyotime Biotechnology | P0203 | |
| 显微镜 | 明场显微镜BX63 | Olympus | -- |
| 荧光显微镜 | 荧光显微镜 | Nikon | TE2000 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 转录组测序 | 样本量：正常组和肿瘤组各4只小鼠；差异基因筛选阈值|logFC|>1.7，p<0.05 阅读提示：Methods 2.1 |
| 细胞培养 | 细胞系及其培养基：LNCaP、VCaP、PC3、DU145、RM-1等；LNCaP-AI细胞在CDS培养基中培养约6个月 阅读提示：Methods 2.2 |
| 基因敲低/过表达 | 慢病毒感染MOI=10，polybrene 5 μg/mL，puromycin筛选10 μg/mL至少1周 阅读提示：Methods 2.3 |
| 药物处理 | NT157浓度5 μM处理6小时；恩杂鲁胺10 μM；LY294002 10 μM 24小时；SC79 4 μg/mL 24小时 阅读提示：Methods 2.3 |
| 双荧光素酶报告实验 | HEK293T和VCaP细胞，IRS2-WT和IRS2-MUT构建，转染后48小时检测 阅读提示：Methods 2.4 |
| ChIP | VCaP细胞，甲醛交联1% 10分钟，超声15次，抗体：anti-IgG（ab172730）和anti-AR（ab108341） 阅读提示：Methods 2.5 |
| 体内动物模型 | 每组10只BALB/c裸鼠；细胞植入量3×10^6；EPI-7170每日口服30 mg/kg；NT157每周腹腔注射50 mg/kg；去势在肿瘤体积约300 mm3时进行 阅读提示：Methods 2.14 |