建立心力衰竭大鼠模型并评估CA治疗效果
构建HF模型并评估CA对心脏功能和心肌损伤的影响。
对Wistar大鼠进行LAD永久结扎构建HF模型，4周后通过超声心动图验证模型成功，然后给予CA(15,30 mg/kg)或卡托普利(10 mg/kg)治疗4周，检测心脏功能、组织病理、氧化应激指标和线粒体超微结构。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
毛蕊异黄酮通过Nrf2/ROS/TXNIP通路减轻心力衰竭中的线粒体损伤和细胞焦亡
Calycosin attenuates mitochondrial damage and pyroptosis in heart failure via the Nrf2/ROS/TXNIP pathway.
实验完整度
高包含大鼠LAD结扎HF模型、H9c2细胞H/R模型及siRNA沉默Nrf2等多层级实验，并进行了功能与机制验证。
主要模型
Wistar大鼠LAD结扎致心力衰竭模型 H9c2心肌细胞缺氧复氧模型
重点核对
CA给药剂量：15和30 mg/kg（腹腔注射） H9c2细胞CA处理浓度：30 μM H/R模型条件：1% O2、5% CO2、94% N2缺氧12h，20% O2、5% CO2、75% N2复氧24h Nrf2 siRNA序列及转染效率 Western blot检测的抗体及稀释比例
摘要
心力衰竭(HF)是全球主要的公共卫生问题，因其高发病率和死亡率。毛蕊异黄酮(CA)是一种类黄酮天然产物，可有效治疗HF并具有心脏保护作用；然而，其作用机制仍不清楚。本研究旨在通过体内和体外实验探讨CA对HF的治疗作用及其机制，并揭示焦亡和线粒体功能障碍在HF病理生理中的作用。在大鼠左前降支动脉结扎4周后构建HF模型。使用缺氧复氧模型模拟心肌缺血再灌注损伤，并通过小干扰RNA转染沉默核因子E2相关因子(Nrf2)以进一步探讨CA的治疗机制。结果表明，CA治疗改善了HF大鼠的心脏功能和心肌损伤，抑制了氧化应激水平并改善了线粒体超微结构。CA通过Nrf2/活性氧(ROS)/硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)通路下调相关焦亡蛋白的表达。体外实验证实了一致的结果，即CA通过降低ROS水平和抑制线粒体gasdermin D N端片段激活来改善线粒体损伤。沉默Nrf2部分逆转了CA的心脏保护作用，证实了CA在Nrf2介导的抗焦亡中的关键治疗作用。总之，CA通过Nrf2/ROS/TXNIP通路抑制HF中的焦亡并改善线粒体损伤，这可能中断线粒体损伤与焦亡之间的串扰，从而发挥心脏保护作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CA是否通过Nrf2/ROS/TXNIP通路抑制心肌细胞焦亡和线粒体损伤，从而改善心力衰竭？
- 核心机制
- CA通过上调Nrf2表达并促进其核转位，降低ROS水平，抑制TXNIP表达，从而抑制NLRP3炎症小体激活和GSDMD介导的焦亡，并减轻线粒体损伤。
- 主要证据
- 体内实验显示CA改善心功能、减轻心肌损伤和氧化应激，并改善线粒体超微结构；体外实验显示CA降低ROS水平、改善线粒体膜电位和呼吸功能，并抑制GSDMD-NT激活。Nrf2沉默部分逆转了这些保护效应。
- 研究意义
- 首次系统阐明CA通过Nrf2/ROS/TXNIP通路减轻HF中线粒体损伤和焦亡，为HF治疗提供了潜在靶点，并为CA的临床应用提供了理论基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测体内氧化应激和线粒体损伤
评估CA对HF大鼠心肌氧化应激和线粒体损伤的影响。
通过ELISA和生化试剂盒检测血清NT-proBNP、LDH、MDA、SOD、T-GSH/GSSG水平；通过透射电镜观察心肌线粒体形态。
验证体内Nrf2/ROS/TXNIP通路和焦亡蛋白表达
明确CA对Nrf2/ROS/TXNIP通路及焦亡相关蛋白的影响。
通过免疫组化检测心肌Nrf2表达，通过Western blot检测Nrf2、TXNIP、NLRP3、ASC、caspase-1、GSDMD、GSDMD-NT、IL-18、IL-1β等蛋白表达。
建立H9c2细胞H/R模型并评估CA保护作用
在细胞水平验证CA对心肌细胞损伤的保护作用及剂量依赖性。
使用缺氧复氧模型处理H9c2细胞，用CCK-8检测细胞活力，LDH释放检测细胞损伤，并用Annexin V-FITC/PI染色检测细胞死亡。
验证Nrf2/ROS/TXNIP通路在细胞水平的作用
验证CA是否通过Nrf2/ROS/TXNIP通路抑制焦亡。
通过免疫荧光检测Nrf2表达和核转位，流式检测ROS水平，Western blot检测通路和焦亡蛋白表达。
评估线粒体功能
评估CA对H/R诱导的线粒体损伤的改善作用。
通过JC-1染色检测线粒体膜电位，MitoSOX Red染色检测线粒体ROS，Seahorse分析OCR和ECAR，Western blot检测线粒体GSDMD、GSDMD-NT和细胞色素c表达。
沉默Nrf2验证机制依赖性
通过siRNA沉默Nrf2验证CA的保护作用通过Nrf2介导。
使用siRNA-Nrf2转染H9c2细胞，检测ROS水平、TXNIP、NLRP3炎症小体和焦亡蛋白表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证氧化应激和线粒体功能
验证机制链路
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | 毛蕊异黄酮 | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | -- |
| 阳性对照药物 | 卡托普利 | Guangdong Pidi Pharmaceutical Co., Ltd. | -- |
| 血清指标检测 | 大鼠NT-proBNP ELISA试剂盒 | Cusabio Technology, LLC | CSB-E08752r |
| LDH ELISA试剂盒 | CLOUD-CLONE CORP, CCC | SEB864Ra | |
| 氧化应激指标检测 | MDA检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A003-1 |
| SOD检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A001-3-2 | |
| 细胞损伤检测 | LDH细胞毒性比色检测试剂盒 | Elabscience | E-BC-K771-M |
| Western blot | Nrf2抗体 | Proteintech Group, Inc. | 80593-1-RR |
| ASC抗体 | Proteintech Group, Inc. | 67494-1-Ig | |
| IL-1β抗体 | Proteintech Group, Inc. | 29530-1-AP | |
| 细胞色素c抗体 | Proteintech Group, Inc. | 66264-1-Ig | |
| β-actin抗体 | Proteintech Group, Inc. | 66009-1-Ig | |
| TXNIP抗体 | ABclonal Biotech Co., Ltd. | A9342 | |
| NLRP3抗体 | ABclonal Biotech Co., Ltd. | A5652 | |
| IL-18抗体 | ABclonal Biotech Co., Ltd. | A23076 | |
| GSDMD抗体 | ABclonal Biotech Co., Ltd. | A24476 | |
| Caspase-1抗体 | Abcam | ab286125 | |
| COX IV抗体 | Abcam | ab16056 | |
| 山羊抗兔IgG HRP | Abcam | ab150077 | |
| 山羊抗小鼠IgG HRP | Abcam | ab205719 | |
| 线粒体膜电位检测 | JC-1检测试剂盒 | Beyotime Institute of Biotechnology | C2006 |
| ROS检测 | ROS检测试剂盒 | Beyotime Institute of Biotechnology | S0033S |
| 线粒体ROS检测 | MitoSOX Red检测试剂盒 | Beyotime Institute of Biotechnology | S0061S |
| 组织染色 | Masson三色染色试剂盒 | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. | G1006 |
| 能量代谢分析 | 细胞线粒体压力检测试剂盒 | Agilent Technologies, Inc. | 103015-100 |
| 糖酵解压力检测试剂盒 | Agilent Technologies, Inc. | 103020-100 | |
| Seahorse XF基础培养基 | Agilent Technologies, Inc. | 102353-100 | |
| 动物实验 | 异氟烷 | -- | -- |
| 磺丁基醚-β-环糊精 | Proteintech Group, Inc. | -- | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Pricella Biotechnology | -- |
| 胎牛血清 | Vazyme Biotech Co., Ltd. | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| 细胞转染 | Opti-MEM培养基 | Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc. | -- |
| Lipofectamine™ 3000转染试剂 | Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc. | -- | |
| siRNA合成 | siRNA-Nrf2 | Beijing Tsingke Biotech Co., Ltd. | -- |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | Vazyme Biotech Co, Ltd. | -- |
| 流式细胞术 | C6 Plus流式细胞仪 | Becton, Dickinson and Company | -- |
| 流式数据分析 | FlowJo 10.6.2 | BD Biosciences | -- |
| 能量代谢分析 | Seahorse XF96分析仪 | Agilent Technologies (China) Co., Ltd. | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. | -- |
| PMSF | Beyotime Institute of Biotechnology | -- | |
| 线粒体蛋白提取 | 线粒体分离和蛋白提取试剂盒 | Proteintech Group, Inc. | -- |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | -- | -- |
| Western blot | PVDF膜 | -- | -- |
| ECL底物溶液 | Vazyme Biotech Co, Ltd. | -- | |
| 统计分析 | SPSS Statistics 27.0 | IBM Corp. | -- |
| GraphPad Prism 10 | Dotmatics | -- | |
| 图像分析 | ImageJ 1.52v | National Institutes of Health | -- |
| 数字切片扫描 | 数字切片扫描仪（WS-10） | Zhiyue Medical Technology (Jiangsu) Co., Ltd. | -- |
| 超声检查 | Mindray M5数字超声扫描仪 | Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd. | -- |
| 细胞死亡检测 | Annexin V-FITC/PI检测试剂盒 | Vazyme Biotech Co, Ltd. | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| HF大鼠模型建立与给药 | 雄性Wistar大鼠（8周龄，180-220g），LAD永久结扎，术后4周确认HF；CA以15或30 mg/kg每日腹腔注射，共4周；阳性对照卡托普利10 mg/kg灌胃；假手术组仅穿线不结扎 阅读提示：Materials and methods: Establishment and treatment of rats |
| 体外H/R模型 | H9c2细胞缺氧12h（1% O2, 5% CO2, 94% N2）复氧24h（20% O2, 5% CO2, 75% N2），CA处理浓度10-30 μM（30 μM用于机制实验） 阅读提示：Materials and methods: Cell culture and treatments |
| Nrf2沉默实验 | 使用三条siRNA混合（Nrf2#1,#2,#3），Lipofectamine 3000转染，转染48小时后检测；siRNA序列见原文 阅读提示：Materials and methods: Cell transfection [small interfering RNA (siRNA)-Nrf2] |
| Western blot检测 | 抗体稀释比例：Nrf2 1:1000, TXNIP 1:1000, NLRP3 1:1000, ASC 1:5000, Caspase-1 1:500, GSDMD 1:1000, IL-1β 1:1000, IL-18 1:1000, COX IV 1:2000, β-actin 1:50000；蛋白上样量20 μg 阅读提示：Materials and methods: Western blotting |
| 氧化应激指标检测 | 血清NT-proBNP和LDH用ELISA；心肌T-GSH/GSSG、SOD、MDA用试剂盒；具体波长：T-GSH/GSSG 405nm, SOD 450nm, MDA 532nm 阅读提示：Materials and methods: Measurement of NT-proBNP, T-GSH/GSSG, MDA, SOD and LDH |