细胞培养与极化
建立M0/M1型小胶质细胞模型，用于后续甲醛信号关联分析。
复苏并培养BV2细胞，通过血清剥夺和NaHSO3处理清除基础甲醛，再用LPS刺激诱导M1极化。
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在活细胞中捕获内源性甲醛以可视化其信号传导的方案
Protocol for trapping transient endogenous formaldehyde in live cells to visualize its signaling.
实验完整度
中方案提供了详细的细胞培养、刺激、探针染色、免疫染色和成像步骤，但缺少对甲醛信号机制的独立功能验证，主要依赖成像和共定位分析。
主要模型
BV2小鼠小胶质细胞系 LPS诱导的M1极化BV2细胞
重点核对
细胞系：BV2 LPS刺激浓度：10 ng/mL，处理24小时 Trami探针染色浓度：5 μM，孵育15分钟 细胞固定方法：预冷甲醇固定15分钟 成像通道：蓝色通道激发405 nm，发射415-470 nm
摘要
甲醛正逐渐被视为一种关键的信号调节因子。在此，我们介绍了Trami，一种能够在活细胞中捕获内源性甲醛并将其瞬时信号转化为稳定的邻近蛋白标记，以供后续信号传导研究的方案。我们描述了探针设计、活细胞给药以及用于信号去卷积的成像程序。Trami为阐明甲醛介导的信号通路提供了一个强大的工具。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何检测活细胞中的内源性甲醛并将其信号与相关信号传导过程关联起来。
- 核心机制
- Trami探针通过甲醛特异的级联反应将瞬时甲醛信号转化为稳定的邻近蛋白标记，并通过荧光信号变化反映甲醛水平。
- 主要证据
- 在LPS刺激的BV2细胞中，Trami探针的荧光强度在415-470nm范围内高于对照，且与CD16免疫荧光信号平行上调，并呈现中等程度的共定位。
- 研究意义
- 该方案为研究不稳定代谢物在疾病相关背景下的信号传导提供了一个广泛适用的平台。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
Trami探针染色
捕获LPS诱导的内源性甲醛并将其转化为稳定的蛋白标记。
使用Trami探针工作液孵育细胞，随后洗去未结合的探针，孵育使探针反应并标记蛋白。
细胞固定与免疫染色
固定细胞并标记甲醛相关信号蛋白CD16和对照蛋白β-tubulin。
用预冷甲醇固定细胞，依次进行透化、封闭、一抗和二抗孵育。
多重成像与分析
可视化甲醛信号与信号蛋白的表达并分析其共定位。
使用共聚焦显微镜在多通道下成像，并进行ZA栈扫描，随后进行荧光强度和共定位分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Thermo Fisher Scientific | Cat#11995065 |
| 胎牛血清 | Thermo Fisher Scientific | Cat#26170043 | |
| 青霉素-链霉素溶液 | Thermo Fisher Scientific | Cat#10378016 | |
| 药物处理 | 脂多糖 | Meilunbio, China | Cat#MB5198 |
| Trami探针染色 | Trami探针 | -- | -- |
| 免疫染色 | 抗CD16抗体 | Abcam | Cat#ab203883 |
| 山羊抗小鼠IgG (H+L)(Elab Fluor 594偶联) | Elabscience, China | Cat#E-AB-1059 | |
| 山羊抗兔IgG (H+L)(Elab Fluor 488偶联) | Elabscience, China | Cat#E-AB-1055 | |
| β-微管蛋白单克隆抗体 | Elabscience, China | Cat#E-AB-48019 | |
| Triton X-100 | Sigma | Cat#X100 | |
| 山羊血清 | Aladdin, China | MP20008-100ml | |
| 封片 | ProLong玻璃抗淬灭封片剂 | Thermo Fisher Scientific | Cat#P36984 |
| 细胞培养 | 共聚焦培养皿 (20 mm) | Nest | -- |
| 成像 | 倒置激光共聚焦显微镜 (FV1000) | Olympus | -- |
| 共聚焦激光扫描显微镜TCS SP8 | Leica Microsystems | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与极化 | 细胞系为BV2，使用5-8代；LPS刺激浓度为10 ng/mL，处理24小时；NaHSO3处理浓度为500 μM，处理30分钟。 阅读提示：请参阅 'Cell propagation' 和 'Stimulating cells with lipopolysaccharide' 部分。 |
| Trami探针染色 | 探针工作液浓度为5 μM，孵育15分钟，反应1小时。 阅读提示：请参阅 'Step-by-step method details' 下的 'Trami probe staining' 部分。 |
| 细胞固定 | 使用预冷甲醇(-20°C)固定15分钟。 阅读提示：请参阅 'Step-by-step method details' 下的 'Cell fixation' 部分。 |
| 免疫染色 | 一抗CD16 (1:400)和β-tubulin (1:2000)孵育12小时；二抗Elab Fluor 594 (1:200)和Elab Fluor 488 (1:200)孵育1小时。 阅读提示：请参阅 'Step-by-step method details' 下的 'Immunostaining' 部分。 |
| 多重成像 | 蓝通道（Trami）激发405 nm，发射415-470 nm；绿通道（CD16）激发495 nm，发射500-555 nm；红通道（β-tubulin）激发590 nm，发射600-640 nm。 阅读提示：请参阅 'Step-by-step method details' 下的 'Multiplex imaging' 部分。 |