WNP脂质纳米颗粒的制备与表征
制备WNP-LNP并验证其物理化学性质与体外递送效率
通过微流控设备制备负载荧光素酶mRNA的WNP、SM-102和MC3-LNP，测定水合粒径、PDI、Zeta电位和包封率，并在HEK 293T细胞中检测荧光素酶表达。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
一种具有新型递送系统、可实现原位表达的安全广谱SARS-CoV-2 mRNA疫苗
A safe and broad-spectrum SARS-CoV-2 mRNA vaccine with a new delivery system for in-situ expression.
实验完整度
高包含体外细胞转染、体内生物发光成像、小鼠免疫与攻毒实验、组织病理学及细胞免疫检测等多个独立证据层级，并进行了功能验证与安全评价。
主要模型
HEK 293T细胞 BALB/c小鼠 C57BL/6小鼠 BHK-21-hACE2细胞 Caco-2-N细胞
重点核对
注射部位肌肉组织mRNA原位表达 血清ALT活性变化 肝脏促炎细胞因子Il1b、Tnfa、Il6 mRNA水平 RBD(WT)特异性IgG抗体水平 针对多种Omicron亚型假病毒的血清中和抑制率
摘要
自2019年底COVID-19暴发以来，全球累计确诊病例已超过7.78亿，死亡人数超过700万，对人类生命健康构成严重威胁，同时给全球经济造成巨大损失。在推荐序贯免疫的阶段，迫切需要能够快速适应新序列、易于工业化生产且具有高安全性和有效性的mRNA疫苗。我们开发了一种脂质纳米颗粒（LNP）系统，命名为WNP，其能够在注射部位实现基本原位表达，并导致肝脏中促炎因子水平较低，从而相比肝脏靶向的递送系统提高了安全性。此外，鉴于SARS-CoV-2快速突变的特性，一项研究使用跨谱系嵌合体和突变补丁策略设计了一种高度免疫原性且能刺激产生广谱有效抗体的抗原。因此，我们使用了包含五个关键突变位点（K417T、L452R、T478K、E484K和N501Y）的相同RBD抗原构型，以实现最佳的广谱效力。我们的结果表明，WNP能够引发与SM-102同样强大的体液免疫反应、更强的细胞免疫反应，并提供一定的保护效果。此外，WNP可应用于针对其他病原体的疫苗开发，并将有助于对未知哺乳动物病毒外溢做出更快速的响应。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何开发一种安全且广谱的SARS-CoV-2 mRNA疫苗，通过新型递送系统实现注射部位原位表达，并引发强效免疫反应？
- 核心机制
- WNP递送系统通过优化离子化脂质结构及组分比例，使mRNA主要在注射部位表达，减少肝脏蓄积及炎症反应，从而增强安全性。
- 主要证据
- 小鼠体内成像显示WNP-mRNA主要在注射部位表达；免疫后小鼠产生强效RBD特异性IgG和针对多种Omicron亚型的假病毒中和抗体；攻毒实验显示肺部病毒载量降低和病理损伤减轻。
- 研究意义
- 该疫苗在动物模型中表现出良好的安全性和保护效力，有望为高风险个体提供针对严重COVID-19的保护，并可能降低长新冠的发生率和严重程度；WNP系统具有广泛的mRNA预防和治疗应用前景。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体内mRNA递送与分布检测
评估WNP系统在小鼠体内的递送效率和mRNA表达分布
将负载荧光素酶mRNA的LNP肌肉注射至C57BL/6小鼠，在不同时间点进行生物发光成像，并检测各器官信号分布。
RBD(M5)-hFc mRNA构建与蛋白表达验证
验证RBD(M5)-hFc mRNA能在细胞内翻译并形成二聚体
将RBD(M5)-hFc mRNA转染HEK 293T细胞，收集上清液，通过非还原SDS-PAGE和Western blot检测蛋白表达及二聚体形成。
疫苗免疫与体液免疫检测
评估WNP疫苗诱导的体液免疫反应
将RBD(M5)-hFc mRNA-LNP肌肉注射免疫BALB/c小鼠，在第14、28天检测血清RBD(WT)特异性IgG水平，同时检测对多种Omicron假病毒的中和活性。
细胞免疫检测
评估疫苗诱导的T细胞免疫反应
在第42天收集脾细胞，用RBD(BA.2)-His蛋白刺激后，通过流式细胞术检测CD4+和CD8+ T细胞中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5的分泌情况。
攻毒保护实验
评估疫苗对SARS-CoV-2 Omicron BA.1感染的保护效果
免疫后第35天用Omicron BA.1病毒滴鼻感染BALB/c小鼠，4天后检测肺组织病毒载量和病理损伤。
复制子递送颗粒抑制实验
评估疫苗血清对XBB.1.5复制子病毒复制的抑制作用
将免疫小鼠血清与XBB.1.5-ΔN-GFP RDPs孵育后感染Caco-2-N细胞，通过荧光显微镜观察和qPCR检测E基因表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
验证细胞免疫反应
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Lonsera | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | -- | |
| RNA合成 | T7 RNA聚合酶 | Kactus | -- |
| N1-甲基假尿苷-5'-三磷酸 | Syngene | -- | |
| 牛痘加帽酶 | Yeasen | -- | |
| 2'-O-甲基转移酶 | Yeasen | -- | |
| LNP制备 | PEG脂质 | Sinopeg | -- |
| 醋酸钠缓冲液 | Coolaber | -- | |
| INano™ L + Myano微流控设备 | Micro & Nano | -- | |
| 超滤离心管 | Millipore | -- | |
| 纳米粒度分析仪 | OMEC | -- | |
| LNP表征 | RiboGreen染料 | Invitrogen | -- |
| 体外转染 | 荧光素酶检测系统 | Vazyme | -- |
| 体内成像 | 荧光素钾盐 | Yeasen | -- |
| IVIS Spectrum成像系统 | PerkinElmer | -- | |
| mRNA转染 | Lipofectamine™ 2000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Western blot | 小鼠抗RBD单克隆抗体 | Sino Biological | -- |
| SDS | Epizyme Biotech | -- | |
| 安全性评估 | 丙氨酸氨基转移酶（ALT/GPT）活性检测试剂盒 | Elabscience | -- |
| H&E染色 | Pinuofei | -- | |
| RNA提取试剂盒 | Vazyme | -- | |
| 逆转录试剂盒 | Vazyme | -- | |
| ELISA | ELISA板 | Corning | -- |
| 山羊抗小鼠IgG（H+L），人吸附-AP | Southern Biotech | -- | |
| Spectra Max iD3酶标仪 | Molecular Devices | -- | |
| 假病毒中和试验 | Bright-Glo™荧光素酶检测系统 | Promega | -- |
| Varioskan LUX酶标仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 流式分析 | CD3 (PC5.5)抗体 | BD Biosciences | -- |
| CD4 (FITC)抗体 | BioLegend | -- | |
| CD8 (APC)抗体 | BioLegend | -- | |
| IFN-γ (PE)抗体 | BioLegend | -- | |
| IL-2 (BV421)抗体 | BioLegend | -- | |
| IL-4 (BV421)抗体 | BioLegend | -- | |
| IL-5 (PE)抗体 | BioLegend | -- | |
| CytoFlex流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- | |
| 攻毒实验 | RNA提取 | -- | -- |
| 逆转录试剂盒 | Takara | -- | |
| qPCR试剂盒 | Yeasen | -- | |
| 复制子抑制实验 | XBB.1.5-ΔN-GFP复制子递送颗粒 | -- | -- |
| qPCR试剂盒 | Yeasen | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| LNP制备与表征 | WNP配方成分及摩尔比；缓冲液pH及流速比；总流速；包封率需约95% 阅读提示：Materials and methods: Lipid nanoparticle (LNP) encapsulation of the mRNA and characterization |
| 体内递送与成像 | 小鼠品系、性别、周龄；注射剂量（0.1 mL含1 μg mRNA）；成像时间点（6、24、48 h）；荧光素钾盐剂量（150 mg/kg） 阅读提示：Materials and methods: Luciferase transfection in vivo; Figure 2 legend |
| 免疫方案 | 免疫剂量（1 μg RNA/只）；免疫次数（2次）；间隔（14天）；小鼠品系、年龄（BALB/c，6-7周龄） 阅读提示：Materials and methods: Mouse vaccination; Figure 4A |
| 体液免疫检测 | ELISA包被蛋白（RBD(WT)-His）；血清稀释倍数；假病毒种类和TCID50（5000）；血清起始稀释倍数（25倍） 阅读提示：Materials and methods: Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA); SARS-CoV-2 pseudoviruses neutralization assay |
| 细胞免疫检测 | 脾细胞数量（1×10^7）；刺激蛋白（RBD(BA.2)-His）浓度5 μg/mL；刺激时间（17h）及Brefeldin A处理（5 ng/mL，5h）；抗体标记方案 阅读提示：Materials and methods: Flow cytometry analyses; Supplementary Fig. S2 |
| 攻毒保护实验 | 攻毒病毒株（Omicron BA.1）；剂量（43,500 PFU）；感染途径（鼻内滴注）；处死时间（4 dpi）；左肺H&E，右肺RNA提取 阅读提示：Materials and methods: Challenge experiment; Figure 5 legend |
| 复制子抑制实验 | Caco-2-N细胞密度（2.5×10^5/孔）；RDPs MOI=0.01；血清与RDPs孵育时间（1h）；感染后检测时间（36h） 阅读提示：Materials and methods: Replicon delivery particles (RDPs) inhibition experiment; Figure 6 legend |