5-羟色胺通过抑制肺腺癌细胞铁死亡调节对阿美替尼的耐药性

5-HT regulates resistance to aumolertinib by attenuating ferroptosis in lung adenocarcinoma.

作者信息Yuanying Feng, Yuchao He, Ran Zuo, Wenchen Gong, Yuan Gao, Yun Wang, Yu Wang, Wenshuai Chen, Liwei Chen, Yi Luo, Dongqi Yuan, Peng Chen, Hua Guo

PMID40897859

期刊EMBO Mol Med

发布时间2025-10

DOI10.1038/s44321-025-00293-5

来源查看原文

实验完整度

高

包含体外细胞实验（CCK-8、克隆形成、Westrn blot、qPCR、ChIP-qPCR、脂质ROS检测）、体内异种移植瘤模型（PC9 S310F小鼠）、患者临床样本分析及类器官实验，并明确进行功能与机制验证。

主要模型

H1975 S310F细胞 PC9 S310F细胞 H3255 S310F细胞 PC9 S310F异种移植瘤小鼠模型

重点核对

HER2 S310F突变是否导致第三代EGFR-TKI耐药（体外IC50和体内肿瘤生长）。 5-HT水平升高是否由MAOA表达下调所致（RNA-seq、qPCR、Western blot、IHC验证）。 HTR3拮抗剂帕洛诺司琼联合阿美替尼是否逆转耐药并促进铁死亡（体外CI分析、克隆形成、体内肿瘤抑制）。 5-HT通过5-HT3受体触发Ca2+内流并激活Ca2+/CAMKK2/AMPK通路，抑制铁死亡（Fluo-4 AM、Western blot、BAPTA-AM处理）。血浆5-HT水平是否可作为EGFR-TKI耐药的预测生物标志物（患者血浆样本检测）。

摘要

对表皮生长因子受体（EGFR）-酪氨酸激酶抑制剂（TKI）的耐药仍然是EGFR突变肺腺癌（LUAD）中的一个关键临床挑战。因此，迫切需要通过基于不同耐药机制的个体化治疗策略来逆转EGFR-TKI耐药。在此，我们发现HER2 S310F突变导致第三代EGFR-TKI耐药，这是由神经递质5-羟色胺（5-HT）的积累驱动的。机制上，5-HT与5-HT3受体相互作用，触发钙离子（Ca2+）内流，随后激活Ca2+/CAMKK2/AMPK通路。这种通路激活赋予铁死亡抗性，从而驱动阿美替尼耐药。通过药物库筛选和转录组学分析，5-HT3受体（HTR3）拮抗剂被确定为逆转阿美替尼耐药的潜在药物。我们证明了通过药理学靶向5-HT/HTR3信号传导，使用临床批准的HTR3拮抗剂帕洛诺司琼，可有效恢复阿美替尼敏感性。重要的是，我们发现患者血浆中升高的5-HT水平在预测EGFR-TKI耐药中发挥潜在作用。我们的数据强调了5-HT和铁死亡在阿美替尼耐药发展中的关键作用，并提出HTR3拮抗剂作为LUAD治疗中与阿美替尼联合的一种新型联合治疗策略。

HER2 S310F突变导致耐药性验证

验证HER2 S310F突变是否导致第三代EGFR-TKI耐药。

在EGFR突变LUAD细胞系（H1975、PC9、H3255）中稳定表达HER2 S310F，通过CCK-8测定阿美替尼和奥希替尼IC50；构建PC9 S310F异种移植瘤模型，比较阿美替尼处理下肿瘤生长。

HTR3拮抗剂的鉴定

鉴定能够逆转HER2 S310F突变介导的耐药性的药物。

基于FDA批准药物库（2972个化合物）的高通量筛选和转录组分析，鉴定HTR3拮抗剂；验证帕洛诺司琼与阿美替尼的协同作用及对IC50、克隆形成的影响。

5-HT积累及其机制研究

探究HER2 S310F突变如何导致5-HT积累。

检测5-HT水平（ELISA）、MAOA表达（RNA-seq、qPCR、Western blot、IHC），并通过MAOA过表达/敲低验证其功能；进一步通过ChIP-qPCR研究P65对MAOA的转录调控。

铁死亡机制验证

阐明5-HT通过铁死亡抑制介导耐药的机制。

检测脂质ROS和铁死亡标志物（GPX4、xCT）；评估5-HT对RSL3诱导的铁死亡的影响；使用Fluo-4 AM检测Ca2+内流，并通过Western blot检测CAMKK2/AMPK/NRF2通路；使用BAPTA-AM和ML385验证通路依赖性。

体内疗效评估

验证帕洛诺司琼联合阿美替尼在体内的抗肿瘤效果和安全性。

使用PC9 S310F异种移植瘤小鼠模型，比较单药和联合治疗组肿瘤生长、体重、肝肾功能及组织学变化，并通过IHC检测铁死亡标志物。

继发性耐药验证

验证帕洛诺司琼是否逆转获得性阿美替尼耐药。

建立H1975 AR（继发耐药）细胞，检测5-HT水平、MAOA表达，评估帕洛诺司琼联合阿美替尼的协同效应及克隆形成抑制；检测患者血浆5-HT水平及肿瘤组织MAOA表达。

环节	核对要点
细胞培养和试剂	细胞系来源（H1975、PC9、H3255、HEK293T）和培养基条件（RPMI 1640、DMEM、10%FBS、1%青霉素/链霉素）。阅读提示：Methods：Cell culture and reagents
HER2 S310F细胞系构建	质粒构建和慢病毒转染，选择标记（嘌呤霉素）和筛选时间（7-10天）。阅读提示：Methods：Plasmid construction and cell transfection
药物处理	药物浓度和处理时间：阿美替尼、奥希替尼、帕洛诺司琼、5-HT、RSL3、BAPTA-AM、ML385。阅读提示：Methods：Cell viability assays；Figure legends（图1C-E，2D-F，3G-I，5G-I）
体外耐药性测定	IC50测定方法（CCK-8）、处理时长（5天）、重复数（n=3或4）。阅读提示：Figure legends（图1C-E，2G，3G-I）
流式细胞术	脂质ROS检测（C11-BODIPY染色）、激发/发射波长（488/525nm）、处理时间（72小时）。阅读提示：Methods：Lipid ROS analysis
动物实验	动物品系（BALB/c裸鼠）、性别、年龄、体重、接种细胞数、给药方案（剂量、频率）、分组方式、肿瘤体积测量频率。阅读提示：Methods：Animal models；Figure legends（图6）
类器官培养	患者肿瘤组织的来源、消化条件（37°C 30-40分钟）、培养基成分（Matrigel浓度）、培养时间（10天）和处理（药物浓度和处理时间）。阅读提示：Methods：Tissue processing and organoid culture；Appendix Fig. S7

环节

核对要点

细胞培养和试剂

细胞系来源（H1975、PC9、H3255、HEK293T）和培养基条件（RPMI 1640、DMEM、10%FBS、1%青霉素/链霉素）。

阅读提示：Methods：Cell culture and reagents

HER2 S310F细胞系构建

质粒构建和慢病毒转染，选择标记（嘌呤霉素）和筛选时间（7-10天）。

阅读提示：Methods：Plasmid construction and cell transfection

药物处理

药物浓度和处理时间：阿美替尼、奥希替尼、帕洛诺司琼、5-HT、RSL3、BAPTA-AM、ML385。

阅读提示：Methods：Cell viability assays；Figure legends（图1C-E，2D-F，3G-I，5G-I）

体外耐药性测定

IC50测定方法（CCK-8）、处理时长（5天）、重复数（n=3或4）。

阅读提示：Figure legends（图1C-E，2G，3G-I）

流式细胞术

脂质ROS检测（C11-BODIPY染色）、激发/发射波长（488/525nm）、处理时间（72小时）。

阅读提示：Methods：Lipid ROS analysis

动物实验

动物品系（BALB/c裸鼠）、性别、年龄、体重、接种细胞数、给药方案（剂量、频率）、分组方式、肿瘤体积测量频率。

阅读提示：Methods：Animal models；Figure legends（图6）

类器官培养

患者肿瘤组织的来源、消化条件（37°C 30-40分钟）、培养基成分（Matrigel浓度）、培养时间（10天）和处理（药物浓度和处理时间）。

阅读提示：Methods：Tissue processing and organoid culture；Appendix Fig. S7

大家都在搜

大家都在搜