基于结构的虚拟筛选
从设计的肽库中筛选靶向Keap1-Nrf2相互作用的候选肽抑制剂。
基于Nrf2 ETGE基序构建144个肽的文库，使用Surflex-Dock进行分子对接，评估与Keap1的结合，选出得分较高的10个候选，进一步通过视觉检查选出6个进行MD模拟。
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靶向Keap1-Nrf2相互作用的新型生物活性肽对抗UVA诱导的皮肤衰老：计算发现与实验验证
Novel bioactive peptides targeting Keap1-Nrf2 interaction for combating UVA-induced skin aging: Computational discovery and experimental validation.
实验完整度
高包含体外细胞实验（HaCaT、Fb）、基因敲除验证（Nrf2/Keap1 siRNA）、体内小鼠模型及多种机制检测（Western blot、qRT-PCR、IF等），证据层级多样且含功能与机制验证。
主要模型
HaCaT细胞（人永生化角质形成细胞） 原代成纤维细胞（Fb） 昆明小鼠UVA光老化模型
重点核对
虚拟筛选流程：基于ETGE基序构建144肽库，经分子对接和MD模拟筛选 肽浓度：细胞实验使用32 μM或更低（多数实验为20 μM） UVA剂量：细胞实验10 J/cm2，小鼠实验2 J/cm2（每周三次） 小鼠分组：对照组（PBS）、UVA+PBS、UVA+Seq1、UVA+Seq3、UVA+ATRA（每组6只） Nrf2和Keap1敲低实验验证靶点依赖性
摘要
紫外线A（UVA）诱导的皮肤衰老对皮肤健康与美观构成重大威胁，然而有效且生物安全的治疗干预措施仍然稀缺。本研究聚焦于识别靶向Kelch样ECH相关蛋白1（Keap1）与核因子E2相关因子2（Nrf2）蛋白-蛋白相互作用（PPI）的生物活性肽抑制剂，以对抗UVA诱导的皮肤衰老。通过计算虚拟筛选，我们鉴定出两种高亲和力、低毒性的肽Seq1和Seq3，它们有效激活了Nrf2-抗氧化反应元件（ARE）通路。这种激活导致抗氧化基因上调，并显著降低氧化应激。此外，这些肽抑制了丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和核因子κB（NF-κB）信号通路，从而减少炎症并抑制基质金属蛋白酶（MMPs）的表达，后者是皮肤衰老的关键因素。体内研究表明，Seq1和Seq3有效预防了UVA诱导的小鼠表皮增厚、胶原蛋白降解以及促炎细胞因子的上调。我们的结果强调了Seq1和Seq3，特别是Seq3，作为靶向Keap1-Nrf2 PPI的新型生物活性肽在对抗UVA诱导的皮肤衰老方面的治疗潜力，为护肤和保健应用提供了有前景的途径。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 本研究旨在开发新型生物活性肽抑制剂，通过靶向Keap1-Nrf2相互作用来对抗UVA诱导的皮肤衰老。
- 核心机制
- Seq1和Seq3通过结合Keap1的Kelch结构域，阻断Keap1-Nrf2相互作用，激活Nrf2-ARE通路，上调抗氧化基因，并抑制MAPK/NF-κB信号通路，从而减少氧化应激和炎症，抑制MMP表达。
- 主要证据
- 体外实验显示肽处理降低UVA诱导的ROS、DNA损伤和SA-β-gal阳性细胞，上调NQO1、HO-1、GCLM表达；基因敲低实验证实效果依赖Nrf2和Keap1；体内小鼠模型显示肽处理减轻表皮增厚、胶原降解和炎症。
- 研究意义
- 作者认为Seq1和Seq3在皮肤光保护和抗衰老护肤品中具有潜在应用价值，但需进一步研究以解决稳定性、规模化生产等挑战。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
MM/GBSA结合能分析
评估候选肽与Keap1的结合亲和力与稳定性。
对MD模拟轨迹提取快照，计算结合自由能，并分解能量项，比较各复合物的结合强弱。
体外活性筛选
检测候选肽对Nrf2-ARE通路的激活能力。
在HepG2细胞中进行ARE-荧光素酶报告基因实验，比较候选肽的激活效率。
结合亲和力验证
确认候选肽与Keap1的直接结合。
使用MST和CETSA技术测定肽与Keap1的结合亲和力和细胞内结合。
体外功能验证
评估Seq1和Seq3在细胞水平对UVA诱导光老化的保护作用。
在HaCaT和原代Fb中，UVA照射后检测细胞活力、迁移、ROS水平、DNA损伤、SA-β-gal活性、MMP和炎症因子表达、抗氧化酶活性及Nrf2下游靶基因。
机制验证（基因敲低）
验证Seq1和Seq3的保护作用是否依赖于Keap1-Nrf2通路。
通过siRNA分别敲低Nrf2和Keap1，观察敲低后肽处理对UVA诱导的DNA损伤、ROS和炎症的影响。
信号通路分析
研究Seq1和Seq3对MAPK/NF-κB信号通路及炎症的调控作用。
检测UVA照射及肽处理后MAPK（ERK、p38）和NF-κB的磷酸化水平，以及下游炎症因子表达，并分析Nrf2激活与NF-κB抑制的时间关系。
体内药效评估
评估Seq1和Seq3在小鼠模型中对慢性UVA诱导皮肤光老化的保护效果。
建立昆明小鼠UVA光老化模型，局部外用肽凝胶，检测表皮厚度、胶原密度、炎症因子、TYR活性和HYP含量等指标。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Gibco | C11875500BT |
| DMEM培养基 | Gibco | C11965500BT | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| ARE-luciferase报告基因实验 | 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | E1980 |
| 脂质体转染试剂 | -- | -- | |
| 叔丁基对苯二酚 | MCE | HY-100489 | |
| MST | Monolith NT.115分子相互作用仪 | NanoTemper Technologies | -- |
| Monolith His-Tag标记试剂盒 | NanoTemper Technologies | MO-L018 | |
| UV诱导细胞光老化 | 细胞光毒性仪器 | HOPE | -- |
| 细胞迁移实验 | EVOS FL Auto显微镜 | Life Technologies | -- |
| ROS检测 | 活性氧检测试剂盒 | Beyotime | S0033S |
| SA-β-gal染色 | SA-β-半乳糖苷酶染色试剂盒 | Beyotime | C0602 |
| DNA损伤检测 | DNA损伤检测试剂盒 | Beyotime | C2035S |
| 免疫荧光 | 曲拉通X-100 | Beyotime | P0096 |
| AF488标记的山羊抗兔IgG（H+L） | Beyotime | A0423 | |
| DAPI | Beyotime | C1002 | |
| 激光扫描共聚焦显微镜 | Zeiss | LSM 800 with Airyscan | |
| 动物实验 | HOPE-MED 8130C动物皮肤光毒性辐照仪 | HOPE | -- |
| 组织病理 | 改良马松三色染色试剂盒 | Solarbio | -- |
| 免疫组化 | HRP标记二抗 | Beyotime | A0208 |
| DAB辣根过氧化物酶底物试剂盒 | Beyotime | P0202 | |
| 封片剂 | Beyotime | C0174 | |
| ELISA | 小鼠IL-1β ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-M0037 |
| 小鼠IL-6 ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-M0044 | |
| 生化指标检测 | 酪氨酸酶活性检测试剂盒 | Boxbio | AKAM010M |
| 羟脯氨酸含量检测试剂盒 | Boxbio | AKAM017M |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 虚拟筛选 | 肽库设计和基于ETGE基序的序列；分子对接软件、评分函数和残基选择 阅读提示：Methods 2.2、2.3及Results 3.1 |
| MD模拟 | 力场参数、水模型、离子种类和浓度、模拟温度、压强、时长和步长 阅读提示：Methods 2.4 |
| 结合能计算 | 快照提取方式和时间范围、计算方法和参数 阅读提示：Methods 2.5 |
| ARE-luciferase报告基因实验 | 细胞类型、转染试剂和比例、转染时间、肽浓度和处理时间 阅读提示：Methods 2.7 |
| MST | 蛋白浓度、肽稀释范围、标记方式和仪器参数 阅读提示：Methods 2.8 |
| CETSA | 细胞裂解方法、肽浓度和处理时间、加热温度和离心条件 阅读提示：Methods 2.9 |
| 细胞UVA照射模型 | UVA剂量（10 J/cm2）、照射天数、肽浓度和预处理时间 阅读提示：Methods 2.10 |
| 基因敲低实验 | siRNA序列、转染方法、转染后处理时间 阅读提示：Methods 2.6（表S4）及Results 3.4 |
| 小鼠光老化模型 | 小鼠品系、性别、周龄、UVA剂量（2 J/cm2）、照射频率、给药方式和浓度、处理周期 阅读提示：Methods 2.16 |
| 组织学分析 | 组织固定方法、切片厚度、染色试剂盒类型 阅读提示：Methods 2.16 |