建立小鼠结肠腺癌恶病质模型
模拟结直肠腺癌相关的癌症恶病质，用于评估QFG的干预效果。
将MC-38小鼠结肠癌细胞（1×10^5个，50μL）接种于6月龄C57BL/6小鼠盲肠浆膜下，构建恶病质模型，分为对照组、模型组、QFG组、谷氨酰胺组和联合组，每组6只，持续干预8周。
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清解扶正颗粒通过恢复肠道菌群稳态和抑制IL-6/NF-κB信号通路减轻结直肠腺癌癌症恶病质
Qingxie Fuzheng granules attenuate cancer cachexia by restoring gut microbiota homeostasis and suppressing IL-6/NF-κB signaling in colorectal adenocarcinoma.
实验完整度
高包含体外细胞培养、体内动物模型（MC-38诱导的结肠腺癌恶病质小鼠），结合16S rRNA测序、HE染色、qPCR、Western blot、流式细胞术、ELISA等多层级验证，明确功能与机制验证。
主要模型
小鼠结肠腺癌恶病质模型（MC-38细胞接种） MC-38小鼠结肠癌细胞
重点核对
小鼠周龄及品系：6月龄C57BL/6小鼠 MC-38细胞接种数量：每只1×10^5个细胞，体积50μL，接种于盲肠浆膜下 分组：对照组、模型组、QFG组、谷氨酰胺组、QFG+谷氨酰胺联合组，每组6只 QFG和谷氨酰胺的给药剂量及方式：文中未明确说明 干预时间：造模后持续8周 样本量：每组6只（测序和ELISA等部分n=3或8）
摘要
癌症恶病质是一种以肌肉消耗和系统性炎症为特征的消耗性综合征，仍然是重大的未满足临床需求。清解扶正颗粒（QFG）是一种传统中药制剂，在癌症治疗中显示出潜力，但其在恶病质管理中的作用尚不清楚。在此，我们在小鼠结肠腺癌诱导的恶病质模型中研究了QFG的抗恶病质作用。16S rRNA测序揭示恶病质小鼠存在肠道菌群失调，肠杆菌科增加，乳杆菌减少。QFG治疗恢复了微生物平衡，降低了促炎细胞因子TNF-α、IL-6，并通过上调紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、Calprotectin增强了肠道屏障完整性。机制上，QFG重新平衡了Th17/Treg细胞比例，并抑制了IL-6/NF-κB信号通路，这是肌肉萎缩的关键驱动因素。QFG与谷氨酰胺（Gln）联合使用进一步增强了这些效应，提示具有协同治疗潜力。我们的研究结果表明，QFG通过微生物群调节和IL-6/NF-κB抑制改善癌症恶病质，为恶病质治疗提供了一种新的多靶点方法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 清解扶正颗粒（QFG）能否改善结直肠腺癌诱导的癌症恶病质，其作用机制是否涉及肠道菌群和IL-6/NF-κB信号通路？
- 核心机制
- QFG通过调节肠道菌群（减少肠杆菌科、增加乳杆菌），修复肠道屏障（上调ZO-1、Occludin、Calprotectin），平衡Th17/Treg细胞比例，并抑制IL-6/NF-κB信号通路，从而减轻肌肉萎缩和全身炎症。
- 主要证据
- 在MC-38诱导的结肠腺癌恶病质小鼠模型中，16S rRNA测序显示QFG逆转菌群失调；HE染色显示结肠组织病理改善；Western blot和ELISA显示促炎细胞因子（TNF-α、IL-6、IL-1β）降低，NF-κB表达抑制；流式细胞术显示Th17/Treg比例趋于正常。
- 研究意义
- 本研究首次证明QFG通过肠道菌群-免疫-炎症轴改善癌症恶病质，为恶病质治疗提供了一种新的多靶点策略，并提示与谷氨酰胺联用具有协同潜力，支持QFG作为晚期结直肠癌辅助治疗的应用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测肠道菌群组成
评估恶病质小鼠和药物干预后肠道菌群的多样性和组成变化。
收集各组小鼠粪便，提取细菌DNA，进行16S rRNA测序（Illumina NovaSeq 6000平台），分析α多样性、β多样性、物种组成和差异菌群。
组织病理学检查
观察结肠组织病理变化，评估QFG对肠道损伤的修复作用。
对各组小鼠结肠组织进行HE染色，在显微镜下观察组织结构、炎症细胞浸润等。
检测炎症因子和紧密连接蛋白表达
评估QFG对炎症因子和肠道屏障相关蛋白表达的影响。
通过qPCR检测结肠组织中IL-1β、IL-6、TNF-α、occludin、claudin-1、Calprotectin、NF-κB、Zonulin的mRNA水平；Western blot检测IL-1β、IL-6、TNF-α、Zonulin、Calprotectin、NF-κB、Occludin的蛋白水平；ELISA检测血浆中TNF-α、IL-18、IL-1β、Leptin、IgG、IgM、IGF1水平。
检测Th17/Treg细胞比例
评估QFG对免疫细胞亚群平衡的影响。
从小鼠脾脏制备单细胞悬液，通过流式细胞术检测CD4+IL-17A+（Th17）和CD4+CD25+FOXP3+（Treg）细胞的比例。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
构建动物模型
检测肠道菌群
组织病理学分析
检测基因表达
检测蛋白表达
检测细胞因子水平
检测免疫细胞比例
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | 11965092 |
| MC-38细胞系 | iCell | iCell-m032 | |
| RNA提取 | Trizol试剂 | CWBIO | CW0580S |
| RNA超纯提取试剂盒 | CWBIO | CW0581M | |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Elabscience | E-BC-K318-M | |
| PVDF膜 | Millipore | IPVH00010 | |
| 抗Occludin抗体 | CST | 91131 | |
| 抗NF-κB抗体 | Abcam | ab307840 | |
| 抗TNF-α抗体 | Cohesion Biosciences | CPA2174 | |
| 抗IL-6抗体 | Cohesion Biosciences | CPA4914 | |
| 抗IL-1β抗体 | Cohesion Biosciences | CPA1586 | |
| 抗Zonulin抗体 | CST | 13663 | |
| 抗Calprotectin抗体 | Invitrogen | MAC378 | |
| 抗β-actin抗体 | Proteintech | 20536-1-AP | |
| HRP标记的山羊抗兔二抗 | Proteintech | SA00002-1 | |
| HRP标记的山羊抗小鼠二抗 | Proteintech | SA00002-2 | |
| ChemiDoc XRS+化学发光成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| 流式细胞术 | FITC标记的抗CD4抗体 | Biolegend | 116003 |
| APC标记的抗CD25抗体 | Biolegend | 102012 | |
| True-Nuclear™转录因子缓冲液套装 | Biolegend | 424401 | |
| PE标记的抗FOXP3抗体 | Invitrogen | 12-5773-82 | |
| PerCP标记的抗IL-17A抗体 | Biolegend | 506944 | |
| ELISA | TNF-α ELISA试剂盒 | RUIXIN Biotech | RX202412M |
| IGF-1 ELISA试剂盒 | RUIXIN Biotech | RX202483M | |
| Leptin ELISA试剂盒 | RUIXIN Biotech | RX202429M | |
| IgM ELISA试剂盒 | RUIXIN Biotech | RX202732M | |
| IgG ELISA试剂盒 | RUIXIN Biotech | RX202736M | |
| IL-1β ELISA试剂盒 | RUIXIN Biotech | RX203063M | |
| IL-18 ELISA试剂盒 | RUIXIN Biotech | RX203064M | |
| SuPerMax3100酶标仪 | 上海闪谱生物科技有限公司 | -- | |
| 16S测序 | E.Z.N.A Mag-Bind土壤DNA提取试剂盒 | -- | -- |
| Qubit3.0 DNA检测试剂盒 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型建立 | MC-38细胞接种数量、注射体积、接种部位（盲肠浆膜下），小鼠品系、周龄、性别、体重，分组及每组样本量 阅读提示：详见“Animal grouping and intervention”部分 |
| 药物干预 | QFG和谷氨酰胺的给药剂量、给药方式（灌胃或饮水）、溶剂、治疗开始时间及持续时间 阅读提示：详见“Animal grouping and intervention”部分，文中未明确说明具体剂量和途径 |
| 16S rRNA测序分析 | 粪便样本收集时间点、存储条件、DNA提取试剂盒、测序平台（Illumina NovaSeq 6000）、数据分析流程（QIIME2等） 阅读提示：详见“16S sequencing”和“Fig. 1” |
| 基因表达检测 | qPCR引物序列（Table 1）、内参基因（β-actin）、反转录试剂盒、PCR扩增条件（变性、退火、延伸温度和时间） 阅读提示：详见“qPCR detection”和“Table 1” |
| 蛋白表达检测 | 组织来源（结肠）、蛋白提取方法（RIPA裂解）、BCA定量试剂盒、抗体信息（品牌、稀释度）、内参蛋白（β-actin） 阅读提示：详见“Western blot staining”和图注（Fig. 8） |
| 免疫细胞比例检测 | 脾脏单细胞制备方法、抗体组合（CD4、CD25、FOXP3、IL-17A）、固定破膜试剂盒（True-Nuclear™）、流式细胞仪型号 阅读提示：详见“Flow cytometry staining”和图注（Fig. 7） |
| 细胞因子检测 | 血浆来源、ELISA试剂盒（品牌和货号）、检测波长、酶标仪型号 阅读提示：详见“ELISA staining”和图注（Fig. 6） |