MSC球状体的形成与基因表达分析
验证3D球状体形成是否增强MSC中与上皮修复、神经营养和免疫调节相关的基因表达。
MSC种子于甲基纤维素包被的96孔板形成球状体，培养24小时；提取RNA进行qPCR分析，比较2D培养与球状体中多个因子（HGF、EGF、KGF、TSP1、IGF-1、BDNF、CNTF、NGF、PEDF、COX2、TSG6、IDO1、IL-1ra、IL-4、IL-10）的表达。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
间充质干细胞球状体组装增强分泌组介导的角膜神经再支配和上皮修复：实验性干眼小鼠模型
Spheroid assembly of mesenchymal stem cells enhances secretome-mediated corneal reinnervation and epithelial repair in a mouse model of experimental dry eye.
实验完整度
高包含体外细胞模型（上皮细胞、TG神经元、巨噬细胞）和体内BAK诱导干眼小鼠模型，并有功能验证和机制探讨。
主要模型
人脐带来源间充质干细胞（MSC）球状体 人角膜上皮细胞系（CRL-11515） 原代小鼠三叉神经节（TG）神经元 RAW264.7小鼠巨噬细胞系 BAK诱导干眼小鼠模型（C57BL/6）
重点核对
MSC球状体形成：20,000细胞/孔种子于甲基纤维素包被的96孔板，培养24小时。 条件培养基收集：3×10^5细胞（2D或15个球状体/孔）种子于6孔板，培养48小时。 上皮增殖实验：5000细胞/孔种子于96孔板，24小时处理，含或不含IL-1β（100 ng/mL），CCK-8和EdU检测。 TG神经元实验：2000神经元/腔种子于μ-slide，3天后处理，H2O2（200 μM）诱导氧化应激，Tuj1免疫染色和NeuronJ分析。 小鼠干眼模型：8周龄雄性C57BL/6小鼠，0.05% BAK每日两次滴眼7天，治疗后每日三次滴眼7天。
摘要
干眼病是一种复杂的眼表疾病，其病理生理机制涉及多因素，包括角膜上皮损伤、慢性炎症和角膜神经功能障碍。其中，角膜神经支配受损尤为关键，因为它破坏神经营养支持和泪液反射，使疾病进展持续并延迟愈合。然而，常规治疗往往只能暂时缓解症状，而不能解决潜在的组织损伤或促进神经再生。这一缺陷凸显了对不仅能抑制炎症，还能恢复角膜神经支配的疗法的需求。在本研究中，我们评估了间充质干细胞（MSC）球状体来源的分泌组——一种富含再生和抗炎因子的无细胞溶液——在干眼病临床前小鼠模型中的治疗潜力。与未处理的对照组相比，接受MSC球状体分泌组处理的眼睛表现出更快的角膜上皮再生、改善的角膜神经再支配和减少的炎症细胞浸润。这些发现表明，MSC球状体来源的分泌组可以同时针对干眼的多个病理特征，促进眼表完整性的恢复，强调了其作为临床相关的、无细胞的干眼及其他眼表疾病再生疗法的潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 探讨MSC球状体来源的分泌组是否比常规2D培养来源的分泌组更能促进干眼症中的角膜上皮修复、神经再支配和炎症抑制。
- 核心机制
- MSC球状体形成上调多种促修复和抗炎因子的表达，如HGF、EGF、KGF、TSP1、IGF-1、BDNF、CNTF、NGF、PEDF、TSG6、IL-1ra、IL-4、IL-10等，这些因子协同促进上皮增殖迁移、神经突起生长和巨噬细胞抗炎。
- 主要证据
- 体外实验中，球状体CM显著增强上皮增殖（CCK-8和EdU）、迁移（划痕实验），促进TG神经元突起生长和抗H2O2氧化损伤，并抑制LPS激活的巨噬细胞炎症因子表达。体内实验中，BAK诱导干眼小鼠模型接受滴眼治疗后，角膜荧光素染色评分降低、表面平滑度改善、神经密度（SBNP和SNT）增加、CD45+细胞浸润减少。
- 研究意义
- 该研究首次证明MSC球状体分泌组在干眼模型中促进角膜神经再生，表明其作为无细胞再生疗法治疗干眼和其他眼表疾病的潜力，为优化和标准化球状体培养及分泌组制备提供了理论基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
角膜上皮细胞增殖与迁移实验
评估MSC分泌组对正常和炎症条件下角膜上皮细胞增殖和迁移的影响，并比较2D和球状体来源的CM。
人角膜上皮细胞（CRL-11515）培养于96孔或48孔板，加入2D或球状体MSC-CM或未条件培养基，在含或不含IL-1β（100 ng/mL）的条件下处理24小时（增殖）或观察至48小时（迁移）。CCK-8和EdU检测增殖，划痕实验检测迁移。
TG神经元突起生长与氧化应激保护实验
评估MSC分泌组对原代TG神经元突起生长的影响及在H2O2诱导氧化应激下的神经保护作用。
TG神经元种子于μ-slide 8孔板，培养3天后更换为2D或球状体MSC-CM或对照，并加入或未加入H2O2（200 μM）处理48小时。免疫染色βIII-tubulin（Tuj1），荧光显微镜成像，ImageJ NeuronJ插件量化神经突起长度。
巨噬细胞免疫调节实验
评估MSC分泌组对LPS激活的巨噬细胞炎症因子表达和分泌的影响。
RAW264.7巨噬细胞种子于6孔板，以100 ng/mL LPS刺激6小时，然后更换为2D或球状体MSC-CM或对照，继续培养24小时。qPCR检测iNOS、IL-1α、IL-1β mRNA表达，ELISA检测IL-6、IL-1β、TNF-α蛋白水平。
BAK诱导干眼模型及体内疗效评估
在BAK诱导的干眼小鼠模型中评估MSC分泌组滴眼液对上皮愈合、表面平滑度、神经再支配和炎症浸润的治疗效果。
8周龄雄性C57BL/6小鼠右眼每日两次滴0.05% BAK共7天诱导干眼，然后随机分为三组（对照、2D CM、球状体CM），每日三次滴眼7天。用荧光素染色评估上皮损伤，环形反射评估表面平滑度，组织学和免疫荧光（Tuj1、CD45）评估神经密度和炎症。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | α-MEM培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 胎牛血清 | Corning | -- | |
| 碱性成纤维细胞生长因子 | PeproTech | -- | |
| 潮霉素B | -- | -- | |
| 遗传霉素 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 球状体形成 | 甲基纤维素 | Sigma-Aldrich | -- |
| RNA提取 | TOOLSmart RNA提取试剂 | BIOTOOLS | -- |
| cDNA合成 | High-Capacity cDNA逆转录试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| qPCR | Genious 2X SYBR Green Fast qPCR Mix | ABclonal | -- |
| QuantStudio 3实时荧光定量PCR系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 上皮细胞培养 | 角质细胞无血清培养基 | -- | -- |
| 表皮生长因子 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 牛垂体提取物 | -- | -- | |
| 胰岛素 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 炎症刺激 | 白细胞介素-1β | PeproTech | -- |
| 增殖检测 | 细胞计数试剂盒-8 | IMT Formosa New Materials | -- |
| E-Click EdU细胞增殖成像检测试剂盒 | Elabscience | -- | |
| 核染色 | DAPI | -- | -- |
| TG神经元分离 | DMEM/F-12培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| II型胶原酶 | Worthington Biochemical | -- | |
| 胰蛋白酶 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 脱氧核糖核酸酶I | Sigma-Aldrich | -- | |
| 抗生素-抗真菌剂 | -- | -- | |
| 5-氟-2'-脱氧尿苷 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| TG神经元培养 | 多聚-L-赖氨酸 | -- | -- |
| 层粘连蛋白 | -- | -- | |
| μ-slide 8孔板 | ibidi | -- | |
| 氧化应激处理 | 过氧化氢 | -- | -- |
| 免疫染色 | βIII-微管蛋白（Tuj1）抗体 | GeneTex | -- |
| 巨噬细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 巨噬细胞刺激 | 脂多糖 | Sigma-Aldrich | -- |
| ELISA | ELISA试剂盒 | R&D Systems | -- |
| 干眼模型诱导 | 苯扎氯铵 | -- | -- |
| 免疫组织化学 | CD45抗体 | Abcam | -- |
| 封片剂 | RapiClear 1.47 | SunJin Lab | -- |
| 统计分析 | GraphPad Prism软件 | GraphPad Software Inc. | 10.4.2 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| MSC培养与球状体形成 | 细胞来源（人脐带MSC）、培养基（α-MEM含20%FBS、4 ng/mL bFGF、30 μg/mL hygromycin B、100 μg/mL geneticin）、球状体形成方法（20,000细胞/孔种子于甲基纤维素包被的96孔板）、培养时间（24小时）。 阅读提示：Materials and methods: MSC spheroid formation and CM collection |
| 条件培养基制备 | 细胞数（3×10^5细胞或15个球状体/孔）、培养板（6孔板）、培养基体积（2 mL）、收集时间（48小时）、离心条件（1000×g, 10分钟）。 阅读提示：Materials and methods: MSC spheroid formation and CM collection |
| 角膜上皮细胞增殖实验 | 细胞系（CRL-11515）、培养基（角质细胞无血清培养基含EGF、牛垂体提取物、胰岛素）、细胞密度（5000细胞/孔）、处理条件（2D或球状体CM、IL-1β 100 ng/mL）、检测时间（24小时）、检测方法（CCK-8、EdU）。 阅读提示：Materials and methods: Assessment of corneal epithelial cell proliferation and migration |
| TG神经元培养与突起生长实验 | 神经元来源（8周龄雄性C57BL/6小鼠）、分离方法（酶消化）、培养板（μ-slide 8孔）、细胞数（2000神经元/孔）、处理（2D或球状体CM、H2O2 200 μM）、处理时间（48小时）、检测（Tuj1免疫染色、NeuronJ分析）。 阅读提示：Materials and methods: TG neuron isolation and neurite outgrowth assay |
| 巨噬细胞免疫调节实验 | 细胞系（RAW264.7）、LPS浓度（100 ng/mL）、刺激时间（6小时）、CM处理时间（24小时）、检测（qPCR、ELISA）。 阅读提示：Materials and methods: Evaluation of the effects of MSC-CM on LPS-activated macrophages |
| BAK诱导干眼小鼠模型与治疗 | 小鼠品系和年龄（8周龄雄性C57BL/6）、BAK浓度（0.05%）、剂量（5 μL/次）、频率（每日两次）、持续时间（7天）、治疗分组（对照、2D CM、球状体CM）、给药频率（每日三次）、给药时间（9:00、13:00、17:00）、持续天数（7天）、终点评估（荧光素染色评分、表面平滑度评分、神经密度、CD45+细胞计数）。 阅读提示：Materials and methods: Induction of dry eye and the topical application of the MSC-derived secretome in mice; Results: Figure 5 和 Figure 6 |