p65与pirin结合验证
验证pirin是否与p65结合并影响p65与DNA的相互作用。
使用重组p65RHR和Fe(III)-pirin，通过SPR、SEC和FP分析pirin对p65与IgκB DNA结合的影响。
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Pirin不与p65结合或调节NFκB依赖性基因表达，但确实调节细胞槲皮素水平。
Pirin does not bind to p65 or regulate NFκB-dependent gene expression but does modulate cellular quercetin levels.
实验完整度
高包含体外结合实验（SPR、SEC、FP）、细胞功能实验（敲低/敲除模型）及体内动物模型（pirin KO小鼠），并进行了机制验证。
主要模型
NIH3T3成纤维细胞（pirin敲低细胞系） 小鼠胚胎成纤维细胞（pirin敲除小鼠来源） 重组p65 Rel同源区（RHR）和Fe(III)-pirin蛋白
重点核对
p65 RHR与Fe(III)-pirin的结合实验（SPR、SEC、FP） pirin敲低NIH3T3细胞（shPirin）中TNFα诱导的NFκB反应基因（IL-6、IκBα）表达 pirin敲除MEF中TNFα诱导的IL-6和IκBα表达 pirin的细胞定位（免疫荧光和细胞分级） pirin对槲皮素的分解活性及CCG-257081的抑制作用
摘要
Pirin是一种非血红素铁结合蛋白，具有多种提议的功能，包括作为p65 NFκB的共激活因子和槲皮素酶活性。我们在此报告，未能证实pirin的主要提议机制，即Fe(III)-pirin与p65的结合。分析型尺寸排阻色谱和荧光偏振研究未检测到相互作用。我们还发现，使用来自pirin敲除小鼠的小鼠胚胎成纤维细胞和pirin敲低NIH3T3成纤维细胞系，pirin对肿瘤坏死因子α激活的p65调控基因转录没有影响。与野生型（WT）细胞相比，pirin缺失细胞中肿瘤坏死因子α激活的p65反应基因mRNA既未增加也未减少。此外，NIH3T3成纤维细胞中的pirin免疫荧光显示主要定位在细胞质，而非细胞核，这与大多数先前研究不同。这通过细胞分级分析得到证实。Pirin确实与内质网（ER）标记蛋白二硫键异构酶共定位，以及细胞质标记。我们通过生化实验证实了pirin的槲皮素酶活性，并证明了pirin抑制剂CCG-257081的竞争性抑制。在体外暴露于槲皮素的细胞中，敲低pirin或使用pirin抑制剂处理可增加细胞槲皮素水平。由于pirin定位于ER，而黄烷醇对ER应激具有保护作用，我们研究了pirin敲低是否改变ER应激信号，但未发现pirin敲低对ER应激反应基因有任何影响。我们的结果挑战了pirin功能（NFκB调节）的主流模型，但证实了其槲皮素酶活性，这对pirin结合小分子的机制具有意义。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 验证pirin是否结合p65并调节NFκB依赖性基因表达，以及pirin是否具有槲皮素酶活性并影响细胞槲皮素水平。
- 核心机制
- pirin不与p65结合，也不调节NFκB依赖性基因表达；pirin主要定位在细胞质/内质网；pirin作为槲皮素酶降解槲皮素，pirin抑制剂可抑制其活性并提高细胞槲皮素水平。
- 主要证据
- 通过SPR、SEC和FP实验未检测到pirin与p65RHR结合；在pirin敲低NIH3T3细胞和pirin敲除MEF中，TNFα诱导的IL-6和IκBα表达无变化；免疫荧光和细胞分级显示pirin主要在细胞质；生化实验证实pirin具有槲皮素酶活性且被CCG-257081抑制，细胞实验显示pirin敲低或抑制剂处理提高细胞槲皮素水平。
- 研究意义
- 挑战了pirin作为NFκB调节因子的主流模型，但证实了其槲皮素酶活性，为理解pirin结合化合物的作用机制提供了新方向。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细胞定位分析
确定pirin在成纤维细胞中的亚细胞定位。
通过免疫荧光和细胞分级分析检测pirin在NIH3T3和MEF中的定位。
NFκB基因表达检测
评估pirin缺失对TNFα诱导的NFκB反应基因表达的影响。
使用pirin敲低NIH3T3细胞和pirin敲除MEF，在TNFα刺激后通过RT-qPCR检测IL-6和IκBα mRNA水平。
槲皮素酶活性测定
验证pirin的槲皮素酶活性及其被pirin抑制剂抑制。
通过体外酶活实验测定pirin对槲皮素的降解速率，并测试CCG-257081的抑制作用。
细胞槲皮素水平检测
检测pirin敲低或抑制剂处理对细胞槲皮素水平的影响。
使用APB荧光法检测暴露于外源槲皮素的细胞内的槲皮素水平。
ER应激基因表达检测
评估pirin敲低对ER应激反应基因表达的影响。
使用衣霉素或毒胡萝卜素诱导ER应激，检测ER应激相关基因（CHOP、ATF4等）的表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白表达与纯化 | His6标签pirin表达质粒 | -- | -- |
| 培养基 | M9最小培养基 | Sigma Aldrich | M6030-1Kg |
| 蛋白纯化 | Superdex 200层析柱 | GE Healthcare | -- |
| PD SpinTrap G-25脱盐柱 | GE Healthcare | -- | |
| SP Sepharose柱 | -- | -- | |
| 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 | Thermo Scientific | A32961 | |
| SPR | 链霉亲和素包被的传感芯片 | ForteBio (now Sartorius) | 19-0130 |
| Pall ForteBio Pioneer表面等离子体共振系统 | ForteBio/Sartorius | -- | |
| Western blot | Licor封闭缓冲液 | Licor | 927-70001 |
| LI-COR Odyssey CLx成像系统 | LI-COR | -- | |
| IRDye 680RD山羊抗大鼠二抗 | Li-Cor | 926-68076 | |
| 荧光偏振 | 黑色384孔板 | Greiner | 781076 |
| BioTek Synergy Neo酶标仪 | BioTek | -- | |
| 细胞培养 | NIH 3T3成纤维细胞 | Elabscience | EP-CL-0171 |
| 新生牛血清 | Gibco | 16010159 | |
| DMEM培养基 | Gibco | 11995-065 | |
| 抗生素/抗有丝分裂剂 | Gibco | 15240-062 | |
| 慢病毒包装 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Thermo Scientific | 11668019 |
| 胎牛血清 | Gibco | 10437-028 | |
| 细胞感染 | 聚凝胺 | -- | -- |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| 基因分型 | Hpy188III限制性内切酶 | New England Biolabs | R0622S |
| MEF制备 | 胰蛋白酶-EDTA (2.5%) | Gibco | 25200-056 |
| RNA提取 | Zymo RNA提取试剂盒 | ZymoGenetics | R1055 |
| cDNA合成 | High-Capacity cDNA逆转录试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 4368814 |
| qPCR | SYBR Green预混液试剂盒 | Thermo Scientific | 4039155 |
| 槲皮素酶活性测定 | 96孔紫外透明微孔板 | Corning | 3679 |
| GraphPad Prism软件 | -- | -- | |
| 细胞槲皮素检测 | 黑色壁/透明底384孔板 | Greiner | 781091 |
| Western blot | RIPA裂解缓冲液 | -- | -- |
| Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Scientific | 23228 | |
| 细胞分级 | 超滤离心管 | Millipore | UFC501096 |
| 免疫细胞化学 | 纤连蛋白 | R&D Systems | 1030-FN |
| 肿瘤坏死因子α | R&D | 210-TA | |
| Image-iT FX信号增强剂 | Invitrogen | R37107 | |
| 山羊血清 (10%) | Vector Labs | S-1000-200 | |
| 一抗：大鼠抗pirin (1E8) | Cell Signaling | 9777S | |
| 二抗：AlexaFluor 488山羊抗大鼠 | Invitrogen | A11006 | |
| ProLong Gold抗淬灭封片剂（含DAPI） | Invitrogen | R36935 | |
| 罗丹明鬼笔环肽 | Cytoskeleton Inc | PHDR1 | |
| Eclipse Ti2-E倒置电动研究显微镜 | Nikon | -- | |
| 免疫细胞化学（ER共定位） | PDI单克隆抗体RL90 | -- | MA3-019 |
| pirin (1E8)大鼠单克隆抗体 | Cell Signaling | 9777 | |
| AlexaFluor-568驴抗小鼠IgG (H+L) | Invitrogen | A10037 | |
| 化合物处理 | CCG-257081 | -- | -- |
| CCT251236 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| p65与pirin结合验证 | 使用重组p65RHR（AA 19-325）和Fe(III)-pirin，注意蛋白浓度；SPR、SEC、FP方法的具体条件 阅读提示：参见Methods 2.2, 2.3, 2.4及图1 |
| 细胞培养与pirin敲低/敲除 | NIH3T3细胞来源（Elabscience #EP-CL-0171），培养基成分（NBCS/DMEM/抗生素），shRNA序列（#2最有效），pirin KO小鼠的构建方式（C57B6，exon 2插入A） 阅读提示：参见Methods 2.5, 2.6, 2.8 |
| NFκB基因表达检测 | TNFα浓度（10 ng/mL），刺激时间（1小时），doxycycline使用（100 ng/mL，72小时） 阅读提示：参见Methods 2.9.1及图3 |
| 槲皮素酶活性测定 | pirin浓度（2.5 μM），底物（槲皮素），抑制剂浓度（0-10 μM CCG-257081），检测波长（380 nm） 阅读提示：参见Methods 2.11及图4A |
| 细胞槲皮素水平检测 | APB浓度（62.5 μg/mL），槲皮素浓度（1 μM），处理时间（40分钟），抑制剂处理（过夜） 阅读提示：参见Methods 2.12及图4B,C |
| ER应激基因表达检测 | 诱导剂（衣霉素5 μg/mL或毒胡萝卜素1 μM），刺激时间（5小时） 阅读提示：参见Methods 2.9.2及图5 |