包被钴胺素对奶牛泌乳性能、养分消化及乳腺上皮细胞增殖和乳脂肪酸合成相关蛋白的影响

Influence of coated cobalamin on lactation performance, nutrient digestion, and proteins related to mammary epithelial cell proliferation and milk fatty acid synthesis in dairy cows.

作者信息Jing Zhang, Jiaojiao Lang, Changjian Xue, Qiang Liu, Caixia Pei
PMID41321533
期刊Anim Nutr
发布时间2025-08-21
DOI10.1016/j.aninu.2025.06.006

实验完整度

包含体内奶牛试验(88头分组、泌乳性能、养分消化、血液代谢物、乳腺组织蛋白表达)和体外细胞实验(BMECs增殖、通路抑制剂验证),涵盖功能验证和机制验证。

主要模型

荷斯坦奶牛(体内试验) 牛乳腺上皮细胞(BMECs,体外)

重点核对

CVB12剂量:0、6、12、18 mg/d(各22头) 体外VB12浓度:0、2.5、5、10、20、40 μmol/L Akt及mTOR抑制剂:30 nmol/L AKT-IN-1、50 pmol/L雷帕霉素 乳腺组织活检:每组6头,产后第3天和第65天取样 饲喂周期:产前6周至产后9周

摘要

钴胺素(维生素B12,VB12)具有增强日粮养分消化、优化能量分配和刺激乳腺上皮细胞(MECs)增殖的潜力,从而促进产奶性能。VB12对养分消化和能量分配的影响已有研究,但其对MECs增殖的作用及潜在机制尚不清楚。本研究探讨了包被VB12(CVB12)对奶牛产奶量、养分消化、MECs增殖和乳脂肪酸合成的影响。这项体内研究涉及88头经产荷斯坦奶牛,其体重(BW;633 ± 16.2 kg)、既往305天产奶量(9035 ± 186.2 kg)、胎次(3.1 ± 0.28)和年龄(5.6 ± 0.31岁)相近。这些奶牛从产前6周至产后9周被选择。它们按胎次、既往产奶量和预期产犊日期进行分组,并分为四个处理组,每组22头:对照组、低CVB12组(LCVB12)、中CVB12组(MCVB12)和高CVB12组(HCVB12),分别每天每头牛接受0、6、12和18 mg VB12。尽管干物质采食量未受影响,但实际产奶量、4%乳脂校正乳、能量校正乳及乳成分(脂肪、真蛋白和乳糖)产量呈二次增加(P < 0.05)。乳脂含量线性增加(P = 0.021),而乳真蛋白和乳糖含量在补充CVB12后无显著变化(P > 0.05)。干物质、有机物、粗蛋白、乙醚提取物、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维的表观养分消化率随CVB12的提供而线性增加(P < 0.05)。血清中VB12、葡萄糖和总蛋白含量线性增加(P < 0.05),而甲基丙二酸、非酯化脂肪酸和β-羟基丁酸含量线性降低(P < 0.05)。补充12 mg/d的CVB12促进了MECs增殖和脂肪酸合成,表现为增殖相关蛋白表达上调、凋亡相关蛋白表达抑制、蛋白激酶B(Akt)和雷帕霉素靶蛋白(mTOR)磷酸化以及脂肪酸合成相关蛋白表达增加。体外研究验证了VB12对MECs增殖的促进作用,并进一步阐明VB12通过Akt/mTOR信号通路调节奶牛MECs增殖。总之,CVB12通过促进养分消化、能量分配以及通过Akt/mTOR信号通路促进MECs增殖和脂肪酸合成相关蛋白表达,从而提高产奶量和乳成分产量。这些发现为未来通过CVB12营养提高奶牛产奶性能的策略提供了坚实的理论基础。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
包被VB12(CVB12)是否通过促进养分消化、MECs增殖和乳脂肪酸合成来提高奶牛产奶量和乳成分?
核心机制
CVB12激活Akt/mTOR信号通路,上调增殖相关蛋白(PCNA、cyclin D1)表达并抑制凋亡相关蛋白(BAX、caspase-3/9),同时上调脂肪酸合成相关蛋白(PPARγ、SREBP1、FASN、SCD1)并抑制AMPK磷酸化,从而促进MECs增殖和乳脂肪合成。
主要证据
体内奶牛试验显示12 mg/d CVB12提高产奶量和乳脂含量,乳腺组织中PCNA、cyclin D1、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR及脂肪酸合成蛋白表达增加;体外BMECs实验证实VB12促进增殖,且AKT-IN-1和雷帕霉素分别阻断Akt和mTOR后消除该作用。
研究意义
为通过CVB12营养改善奶牛产奶性能提供理论依据,并提示12 mg/d为最佳补充剂量。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

体内动物试验设计

评估不同剂量CVB12对奶牛泌乳性能、养分消化和血液代谢物的影响

选择88头经产荷斯坦奶牛,分为对照组、低、中、高剂量组(0, 6, 12, 18 mg/d VB12),从产前6周至产后9周饲喂。测量DMI、产奶量、乳成分、养分消化率和血液代谢物。

2

乳腺组织蛋白表达分析

检测CVB12对MECs增殖、凋亡及脂肪酸合成相关蛋白表达的影响

采集对照组和MCVB12组(12 mg/d)奶牛的乳腺组织,通过Western blot检测PCNA、cyclin D1、BCL2、BAX、caspase-3/9、Akt/mTOR磷酸化及脂肪酸合成相关蛋白(PPARγ、SREBP1、FASN等)的表达。

3

体外细胞增殖实验

验证VB12对BMECs增殖的影响及最佳浓度

分离培养BMECs,用不同浓度VB12(0-40 μmol/L)处理3天,通过CCK-8和EdU实验检测细胞增殖。

4

信号通路机制验证

验证Akt/mTOR信号通路是否介导VB12对BMECs增殖的促进作用

使用Akt抑制剂(AKT-IN-1)和mTOR抑制剂(雷帕霉素)处理BMECs,检测细胞增殖和相关蛋白表达的变化。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
维生素B12Ningxia Jinwei Pharmaceutical Co., Ltd.Ning Si Tian Zi [2020] T01799
二氧化硅Sichuan Jiuda salt production Co., Ltd.Chuan Si Tian Zi [2014] 119001
棕榈酸Fengyi Oil Technology Co., Ltd.Q/YHTJC001G-2021
硬脂酸Deyuan High-tech Co., Ltd.Q/320682 NKF05–2018
硬脂酸钙Huzhou City Linghu Xinwang Chemical Co., Ltd.GB 1886.102–2016
Milko Scan乳品分析仪(FT-120)Foss Electric--
真空恒温干燥箱(DZF-6020)Jinan Senya Experimental Instrument Co., Ltd.--
高温电阻炉(AY-BF-888–10)Henan Andy High Temperature Products Co., Ltd.--
凯氏定氮仪2300FOSS Analytical A/S--
索氏提取系统HTFOSS Analytical A/S--
可见分光光度计(722S)Shanghai Precision Scientific Instrument Co., Ltd.--
纤维分析仪(Fibertec 8000)FOSS Analytical A/S--
原子吸收分光光度计(AAS9000)Jiangsu Skyray Instrument Co., Ltd.--
钴胺素检测试剂盒 (kt22402)Moshak Biotechnology Co., Ltd.--
甲基丙二酸检测试剂盒 (kt22145)Moshak Biotechnology Co., Ltd.--
葡萄糖检测试剂盒 (CB10623-Bv)Shanghai Coaibo Biotechnology Co., Ltd.--
总蛋白检测试剂盒 (CB10659-Bv)Shanghai Coaibo Biotechnology Co., Ltd.--
甘油三酯检测试剂盒 (CB10055-Bv)Shanghai Coaibo Biotechnology Co., Ltd.--
非酯化脂肪酸检测试剂盒 (CB10148-Bv)Shanghai Coaibo Biotechnology Co., Ltd.--
β-羟基丁酸检测试剂盒 (CB10016-Bv)Shanghai Coaibo Biotechnology Co., Ltd.--
DMEM-F12培养基----
CCK-8试剂盒(E-CK-A362)Elabscience Biotechnology Inc.--
Cell-Light EdU(KGA331-100)Jiangsu Keygen Biotechnology Co., Ltd.--
Apollo染色Apollo Scientific Ltd.--
Hoechst 33342Ribobio Biological Technology Co., Ltd.--
倒置显微镜Leica Microsystem CMS GmbH--
BCA蛋白定量试剂盒(23225)Thermo Fisher Scientific Inc.--
SDS-PAGE凝胶(ACR17804)Thermo Fisher Scientific Inc.--
硝酸纤维素膜(1704271)Bio-Rad Laboratories Inc.--
牛血清白蛋白(A8020)Shanghai Solarbio Bioscience & Technology Co., Ltd.--
TBST缓冲液(T1082)Beijing Solarbio Technology Co., Ltd.--
抗cyclin D1抗体(60186)Proteintech Group Inc.60186
抗PCNA抗体(2586)Cell Signaling Technology Inc.2586
抗Akt抗体(9272)Cell Signaling Technology Inc.9272
抗β-actin抗体(4970)Cell Signaling Technology Inc.4970
抗SREBP1抗体(NB100–2215)Novus Biologicals Inc.NB100–2215
抗BCL2抗体(20351R)Beijing Biosynthesis Biotechnology Co., Ltd.20351R
抗BAX抗体(0127M)Beijing Biosynthesis Biotechnology Co., Ltd.0127M
抗caspase-3抗体(0081R)Beijing Biosynthesis Biotechnology Co., Ltd.0081R
抗caspase-9抗体(0049R)Beijing Biosynthesis Biotechnology Co., Ltd.0049R
抗磷酸化Akt Ser473抗体(0876R)Beijing Biosynthesis Biotechnology Co., Ltd.0876R
抗mTOR抗体(1992R)Beijing Biosynthesis Biotechnology Co., Ltd.1992R
抗磷酸化mTOR Ser2448抗体(3495R)Beijing Biosynthesis Biotechnology Co., Ltd.3495R
抗AMPK抗体(1115R)Beijing Biosynthesis Biotechnology Co., Ltd.1115R
抗磷酸化AMPK抗体(5551R)Beijing Biosynthesis Biotechnology Co., Ltd.5551R
抗PPARγ抗体(4590R)Beijing Biosynthesis Biotechnology Co., Ltd.4590R
抗ACACA抗体(#11912R)Beijing Biosynthesis Biotechnology Co., Ltd.#11912R
抗磷酸化ACACA抗体(12954R)Beijing Biosynthesis Biotechnology Co., Ltd.12954R
抗FASN抗体(60347R)Beijing Biosynthesis Biotechnology Co., Ltd.60347R
抗SCD1抗体(3787R)Beijing Biosynthesis Biotechnology Co., Ltd.3787R
山羊抗兔二抗(E-AB-1003)Wuhan Elabscience Biotechnology Co., Ltd.E-AB-1003
山羊抗小鼠二抗(RS0001)ImmunoWay Biotechnology Co.RS0001
Super Signal West Pico化学发光底物(BMU102-CN)Abbkine Scientific Co., Ltd.BMU102-CN
真空采血管(10mL)Hunan Liuyang Medical Instrument Co., Ltd.--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
体内动物试验
奶牛品种、胎次、体重、产奶量;分组和剂量;饲喂周期
阅读提示:见Materials and methods 2.3节
乳腺组织采样
采样时间(产后第3天和第65天)、采样部位、每组牛数(6头)
阅读提示:见Materials and methods 2.4节
血液采样
采样时间(产后第64天)、采血部位、分离条件
阅读提示:见Materials and methods 2.4节
体外细胞培养
VB12浓度(0-40 μmol/L)、处理时间(3天)、细胞接种密度
阅读提示:见Materials and methods 2.6节和Results 3.2节
信号通路抑制实验
AKT-IN-1浓度(30 nmol/L)、雷帕霉素浓度(50 pmol/L)、VB12浓度(20 μmol/L)
阅读提示:见Results 3.2节和图4、图5
蛋白表达检测
抗体来源和稀释比例、蛋白上样量(20 μg)、内参(β-actin)
阅读提示:见Materials and methods 2.7节