体内动物试验设计
评估不同剂量CVB12对奶牛泌乳性能、养分消化和血液代谢物的影响
选择88头经产荷斯坦奶牛,分为对照组、低、中、高剂量组(0, 6, 12, 18 mg/d VB12),从产前6周至产后9周饲喂。测量DMI、产奶量、乳成分、养分消化率和血液代谢物。
Influence of coated cobalamin on lactation performance, nutrient digestion, and proteins related to mammary epithelial cell proliferation and milk fatty acid synthesis in dairy cows.
包含体内奶牛试验(88头分组、泌乳性能、养分消化、血液代谢物、乳腺组织蛋白表达)和体外细胞实验(BMECs增殖、通路抑制剂验证),涵盖功能验证和机制验证。
荷斯坦奶牛(体内试验) 牛乳腺上皮细胞(BMECs,体外)
CVB12剂量:0、6、12、18 mg/d(各22头) 体外VB12浓度:0、2.5、5、10、20、40 μmol/L Akt及mTOR抑制剂:30 nmol/L AKT-IN-1、50 pmol/L雷帕霉素 乳腺组织活检:每组6头,产后第3天和第65天取样 饲喂周期:产前6周至产后9周
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估不同剂量CVB12对奶牛泌乳性能、养分消化和血液代谢物的影响
选择88头经产荷斯坦奶牛,分为对照组、低、中、高剂量组(0, 6, 12, 18 mg/d VB12),从产前6周至产后9周饲喂。测量DMI、产奶量、乳成分、养分消化率和血液代谢物。
检测CVB12对MECs增殖、凋亡及脂肪酸合成相关蛋白表达的影响
采集对照组和MCVB12组(12 mg/d)奶牛的乳腺组织,通过Western blot检测PCNA、cyclin D1、BCL2、BAX、caspase-3/9、Akt/mTOR磷酸化及脂肪酸合成相关蛋白(PPARγ、SREBP1、FASN等)的表达。
验证VB12对BMECs增殖的影响及最佳浓度
分离培养BMECs,用不同浓度VB12(0-40 μmol/L)处理3天,通过CCK-8和EdU实验检测细胞增殖。
验证Akt/mTOR信号通路是否介导VB12对BMECs增殖的促进作用
使用Akt抑制剂(AKT-IN-1)和mTOR抑制剂(雷帕霉素)处理BMECs,检测细胞增殖和相关蛋白表达的变化。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 制备CVB12 | 维生素B12 | Ningxia Jinwei Pharmaceutical Co., Ltd. | Ning Si Tian Zi [2020] T01799 |
| 二氧化硅 | Sichuan Jiuda salt production Co., Ltd. | Chuan Si Tian Zi [2014] 119001 | |
| 棕榈酸 | Fengyi Oil Technology Co., Ltd. | Q/YHTJC001G-2021 | |
| 硬脂酸 | Deyuan High-tech Co., Ltd. | Q/320682 NKF05–2018 | |
| 硬脂酸钙 | Huzhou City Linghu Xinwang Chemical Co., Ltd. | GB 1886.102–2016 | |
| 饲料分析 | Milko Scan乳品分析仪(FT-120) | Foss Electric | -- |
| 真空恒温干燥箱(DZF-6020) | Jinan Senya Experimental Instrument Co., Ltd. | -- | |
| 高温电阻炉(AY-BF-888–10) | Henan Andy High Temperature Products Co., Ltd. | -- | |
| 凯氏定氮仪2300 | FOSS Analytical A/S | -- | |
| 索氏提取系统HT | FOSS Analytical A/S | -- | |
| 可见分光光度计(722S) | Shanghai Precision Scientific Instrument Co., Ltd. | -- | |
| 纤维分析仪(Fibertec 8000) | FOSS Analytical A/S | -- | |
| 原子吸收分光光度计(AAS9000) | Jiangsu Skyray Instrument Co., Ltd. | -- | |
| 血液代谢物分析 | 钴胺素检测试剂盒 (kt22402) | Moshak Biotechnology Co., Ltd. | -- |
| 甲基丙二酸检测试剂盒 (kt22145) | Moshak Biotechnology Co., Ltd. | -- | |
| 葡萄糖检测试剂盒 (CB10623-Bv) | Shanghai Coaibo Biotechnology Co., Ltd. | -- | |
| 总蛋白检测试剂盒 (CB10659-Bv) | Shanghai Coaibo Biotechnology Co., Ltd. | -- | |
| 甘油三酯检测试剂盒 (CB10055-Bv) | Shanghai Coaibo Biotechnology Co., Ltd. | -- | |
| 非酯化脂肪酸检测试剂盒 (CB10148-Bv) | Shanghai Coaibo Biotechnology Co., Ltd. | -- | |
| β-羟基丁酸检测试剂盒 (CB10016-Bv) | Shanghai Coaibo Biotechnology Co., Ltd. | -- | |
| 细胞培养 | DMEM-F12培养基 | -- | -- |
| 细胞增殖检测 | CCK-8试剂盒(E-CK-A362) | Elabscience Biotechnology Inc. | -- |
| Cell-Light EdU(KGA331-100) | Jiangsu Keygen Biotechnology Co., Ltd. | -- | |
| 细胞染色 | Apollo染色 | Apollo Scientific Ltd. | -- |
| Hoechst 33342 | Ribobio Biological Technology Co., Ltd. | -- | |
| 显微镜观察 | 倒置显微镜 | Leica Microsystem CMS GmbH | -- |
| Western blot | BCA蛋白定量试剂盒(23225) | Thermo Fisher Scientific Inc. | -- |
| SDS-PAGE凝胶(ACR17804) | Thermo Fisher Scientific Inc. | -- | |
| 硝酸纤维素膜(1704271) | Bio-Rad Laboratories Inc. | -- | |
| 牛血清白蛋白(A8020) | Shanghai Solarbio Bioscience & Technology Co., Ltd. | -- | |
| TBST缓冲液(T1082) | Beijing Solarbio Technology Co., Ltd. | -- | |
| 抗cyclin D1抗体(60186) | Proteintech Group Inc. | 60186 | |
| 抗PCNA抗体(2586) | Cell Signaling Technology Inc. | 2586 | |
| 抗Akt抗体(9272) | Cell Signaling Technology Inc. | 9272 | |
| 抗β-actin抗体(4970) | Cell Signaling Technology Inc. | 4970 | |
| 抗SREBP1抗体(NB100–2215) | Novus Biologicals Inc. | NB100–2215 | |
| 抗BCL2抗体(20351R) | Beijing Biosynthesis Biotechnology Co., Ltd. | 20351R | |
| 抗BAX抗体(0127M) | Beijing Biosynthesis Biotechnology Co., Ltd. | 0127M | |
| 抗caspase-3抗体(0081R) | Beijing Biosynthesis Biotechnology Co., Ltd. | 0081R | |
| 抗caspase-9抗体(0049R) | Beijing Biosynthesis Biotechnology Co., Ltd. | 0049R | |
| 抗磷酸化Akt Ser473抗体(0876R) | Beijing Biosynthesis Biotechnology Co., Ltd. | 0876R | |
| 抗mTOR抗体(1992R) | Beijing Biosynthesis Biotechnology Co., Ltd. | 1992R | |
| 抗磷酸化mTOR Ser2448抗体(3495R) | Beijing Biosynthesis Biotechnology Co., Ltd. | 3495R | |
| 抗AMPK抗体(1115R) | Beijing Biosynthesis Biotechnology Co., Ltd. | 1115R | |
| 抗磷酸化AMPK抗体(5551R) | Beijing Biosynthesis Biotechnology Co., Ltd. | 5551R | |
| 抗PPARγ抗体(4590R) | Beijing Biosynthesis Biotechnology Co., Ltd. | 4590R | |
| 抗ACACA抗体(#11912R) | Beijing Biosynthesis Biotechnology Co., Ltd. | #11912R | |
| 抗磷酸化ACACA抗体(12954R) | Beijing Biosynthesis Biotechnology Co., Ltd. | 12954R | |
| 抗FASN抗体(60347R) | Beijing Biosynthesis Biotechnology Co., Ltd. | 60347R | |
| 抗SCD1抗体(3787R) | Beijing Biosynthesis Biotechnology Co., Ltd. | 3787R | |
| 山羊抗兔二抗(E-AB-1003) | Wuhan Elabscience Biotechnology Co., Ltd. | E-AB-1003 | |
| 山羊抗小鼠二抗(RS0001) | ImmunoWay Biotechnology Co. | RS0001 | |
| Super Signal West Pico化学发光底物(BMU102-CN) | Abbkine Scientific Co., Ltd. | BMU102-CN | |
| 血液采样 | 真空采血管(10mL) | Hunan Liuyang Medical Instrument Co., Ltd. | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体内动物试验 | 奶牛品种、胎次、体重、产奶量;分组和剂量;饲喂周期 阅读提示:见Materials and methods 2.3节 |
| 乳腺组织采样 | 采样时间(产后第3天和第65天)、采样部位、每组牛数(6头) 阅读提示:见Materials and methods 2.4节 |
| 血液采样 | 采样时间(产后第64天)、采血部位、分离条件 阅读提示:见Materials and methods 2.4节 |
| 体外细胞培养 | VB12浓度(0-40 μmol/L)、处理时间(3天)、细胞接种密度 阅读提示:见Materials and methods 2.6节和Results 3.2节 |
| 信号通路抑制实验 | AKT-IN-1浓度(30 nmol/L)、雷帕霉素浓度(50 pmol/L)、VB12浓度(20 μmol/L) 阅读提示:见Results 3.2节和图4、图5 |
| 蛋白表达检测 | 抗体来源和稀释比例、蛋白上样量(20 μg)、内参(β-actin) 阅读提示:见Materials and methods 2.7节 |