数据收集与预处理
获取AS相关基因表达和单细胞数据，并进行标准化。
从GEO数据库提取多个数据集，使用limma包进行预处理，包括探针ID转换和基因符号去重。
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利用机器学习和生物信息学识别和诊断动脉粥样硬化中的裂解性细胞死亡基因。
Identifying and Diagnosing Lytic Cell Death Genes in Atherosclerosis Using Machine Learning and Bioinformatics.
实验完整度
高包含多数据集转录组分析、单细胞测序、机器学习建模、动物模型、组织学、ELISA和Western blot等多层级验证。
主要模型
ApoE敲除小鼠动脉粥样硬化模型 人动脉粥样硬化组织样本（GSE100927等） 单细胞测序样本（GSE155512人、GSE155513小鼠）
重点核对
GSE100927数据集（35例正常和69例AS）用于主要分析，GSE57691、GSE43292和GSE28829作为独立验证集。 ANN模型构建参数：hidden=5，learning rate=0.01，训练集：测试集=70%:30%。 筛选特征基因的阈值：DEGs筛选为adj.P<0.05且|log2FC|>1，LASSO和RF算法用于筛选。 动物模型分组：ApoE−/−小鼠分为早期组（标准饮食6周后高脂饮食6周）和晚期组（高脂饮食12周），每组n=6。 CYBB作为生物标志物验证，通过ELISA、免疫组化和Western blot检测。
摘要
背景：裂解性细胞死亡在动脉粥样硬化等慢性炎症性疾病中日益受到研究关注。本研究利用机器学习和生物信息学探讨LCD在AS中的作用及机制。方法：我们从GEO数据库获取基因表达数据和单细胞测序数据。差异分析鉴定差异表达基因，并与LCD相关基因取交集以确定LCD相关DEGs。使用机器学习筛选特征性LCDEGs，并构建人工神经网络模型。通过ROC曲线评估模型的诊断准确性。结果：结果表明，ANN模型在区分正常与AS病例以及识别早期和晚期阶段方面具有强大的诊断能力。使用共识聚类方法确定了独特的AS亚型。基于免疫景观分析和基因集变异分析功能富集，划分了两种亚型：C1（非免疫亚型）和C2（免疫亚型）。卡方检验显示C1与早期（低风险）动脉粥样硬化斑块相关，而C2与晚期（高风险）动脉粥样硬化斑块相关。在单细胞水平上，使用AUCell和AddModuleScore计算LCDEGs活性。在最初分类的细胞亚型中，LCDEGs在巨噬细胞中表现出升高的活性水平。此外，在特定巨噬细胞亚型分析中，它们在“炎症”亚型中表现出更高的活性。结论：本研究强调了LCD在AS中的临床潜力，并提示其涉及巨噬细胞介导的机制。我们还通过实验鉴定并验证了细胞色素B-245β链（CYBB）作为AS的潜在生物标志物。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 裂解性细胞死亡在动脉粥样硬化中的作用及机制，以及其诊断和生物标志物潜力。
- 核心机制
- LCD相关基因，特别是CYBB，通过巨噬细胞介导的炎症机制参与AS的发生发展。
- 主要证据
- 多数据集转录组分析、功能富集、机器学习模型、单细胞测序显示LCDEGs在巨噬细胞中高表达，动物实验验证CYBB表达升高与AS进展相关。
- 研究意义
- 研究为AS的诊断和治疗提供了新的见解，CYBB可能作为AS的潜在生物标志物，ANN模型和亚型分类可能有助于临床风险评估。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
鉴定LCD相关DEGs
筛选与AS相关的LCD差异表达基因。
使用limma包进行差异表达分析（adj.P<0.05, |log2FC|>1），并与LCDGs取交集得到12个LCDEGs。
功能富集和蛋白互作分析
探索LCDEGs参与的生物学通路和蛋白互作。
使用clusterProfiler进行GO/KEGG富集，STRING和GeneMANIA构建PPI网络。
机器学习筛选特征基因并构建ANN模型
确定LCD相关的特征基因并建立诊断模型。
使用LASSO和RF算法筛选特征基因，利用neuralnet构建ANN模型，用ROC曲线评估性能。
共识聚类和亚型鉴定
基于LCDEGs表达鉴定AS亚型并分析其临床意义。
使用ConsensusClusterPlus进行共识聚类，评估亚型与疾病阶段关联，分析免疫浸润。
单细胞RNA测序分析
在单细胞水平评估LCDEGs活性及细胞类型。
处理GSE155512和GSE155513数据，使用Seurat聚类，AUCell和AddModuleScore评分，分析巨噬细胞亚型。
CYBB作为生物标志物的实验验证
验证CYBB表达与AS进展的相关性。
使用ApoE−/−小鼠模型，通过ELISA检测血清CYBB和炎性因子，HE染色和免疫组化评估斑块，Western blot检测蛋白表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
差异表达分析
统计和生存分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 脂质和细胞因子检测 | 甘油三酯测定试剂盒 | Elabscience | E-TSEL-H0025 |
| 总胆固醇测定试剂盒 | Elabscience | E-BC-K109-M | |
| 高密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒 | Elabscience | E-BC-K221-M | |
| 低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒 | Elabscience | E-BC-K205-M | |
| 小鼠Cybb/细胞色素b-245重链（CYBB）ELISA试剂盒 | Elabscience | E-AB-70273 | |
| 小鼠白细胞介素1β（IL-1β）ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-M0037c | |
| 小鼠肿瘤坏死因子α（TNF-α）ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-M3063 | |
| 小鼠白细胞介素6（IL-6）ELISA试剂盒 | Elabscience | E-AB-F1207UD | |
| 组织学 | 抗CYBB抗体 | Servicebio | GB112362-50 |
| Western blot | BCA蛋白浓度测定试剂盒 | Beyotime Biotechnology | P0010 |
| PVDF膜 | Millipore | ISEQ00010 | |
| 10% SDS-PAGE凝胶 | Beyotime Biotechnology | P0690 | |
| 抗NOX2/gp91phox抗体 | Abcam | EPR28415-13 | |
| 山羊抗兔IgG H&L（HRP） | Abcam | ab6721 | |
| ECL试剂盒 | Tanon | 180-5001 | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Abcam | ab8227 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 数据预处理和差异表达分析 | 数据集GSE100927包含35例正常和69例AS样本；筛选标准为调整P<0.05和|log2FC|>1。 阅读提示：Methods: Preprocessing of Gene Expression Profile, Identification of LCD-Associated DEGs |
| 机器学习建模 | LASSO参数：family=binomial, alpha=1, nfolds=10；RF参数：ntree=500；ANN参数：hidden=5, learning rate=0.01；数据划分：70%训练，30%测试。 阅读提示：Methods: Screening LCD-Associated Signature Genes of AS via Machine Learning |
| 共识聚类 | 基于69个AS样本和12个LCDEGs表达谱，使用ConsensusClusterPlus，迭代1000次，k=2。 阅读提示：Methods: Consensus Clustering |
| 单细胞RNA测序 | GSE155512（3个AS人样本）和GSE155513（6个小鼠样本）；过滤标准：基因表达在至少3个细胞，细胞表达>200基因，线粒体<20%，UMI≥100；聚类分辨率0.6。 阅读提示：Methods: Processing of Single-Cell RNA-Sequencing Data and Identification of Cell Subpopulations |
| 动物模型 | 6只C57BL/6J小鼠和12只ApoE−/−小鼠（6周龄，雄性）；ApoE−/−分为早期组（标准饮食6周+高脂饮食6周）和晚期组（高脂饮食12周），每组n=6。 阅读提示：Methods: Animal Model |
| 实验验证 | ELISA检测血清TC、TG、HDL-C、LDL-C、CYBB和炎性因子（IL-1β、TNF-α、IL-6）；HE染色和免疫组化评估斑块面积；Western blot检测CYBB表达，β-actin作为内参。 阅读提示：Methods: Cytokines and Plasma Lipid Analysis, Histology and Immunohistochemistry, Western Blotting |