淫羊藿苷对犬睾丸热应激诱导的生精功能障碍疗效的评估

Evaluation of the efficacy of icariin against heat stress-induced spermatogenic dysfunction in the testes of dogs.

作者信息Baoan Li, Liuwei Xie, Mingqiang Song, Xiumin Zhang, Chuanguo Yan, Wanpeng Gao, Wenxing Wang, Yang Yang
PMID40671828
发布时间2025-07-12
DOI10.3389/fvets.2025.1631149

实验完整度

包含体外分子对接、体内动物模型(犬热应激模型)、多种功能检测(精子质量、激素、ATP酶)及机制验证(Western blot、组织学)

主要模型

成年雄性比格犬睾丸热应激模型 17βHSD蛋白靶点(分子对接)

重点核对

睾丸热应激模型:45°C水浴,每天30分钟,连续4天 淫羊藿苷剂量:0.5 g/kg和1.0 g/kg,每日口服 实验周期:21天,包括7天预饲和14天正式实验 样本量:每组6只犬 统计显著性:p < 0.05为显著,p < 0.01为极显著

摘要

本研究探讨了高温环境对犬睾丸功能和生殖健康的有害影响,并研究了淫羊藿叶及其活性成分淫羊藿苷在缓解这些影响和改善睾丸功能方面的潜力。采用完全随机单因素设计,涉及24只成年雄性比格犬(9.82 ± 0.73 kg),随机分为四个处理组,每组6只。各组包括阴性对照组(“Control”)、暴露于睾丸热应激的阳性对照组(“Model”),以及两个淫羊藿苷处理组,分别每天给予0.5 g/kg(Icariin-L)和1.0 g/kg(Icariin-H)。除阴性对照组外,所有组均接受睾丸热应激模型以诱导损伤,并评估淫羊藿苷对精子质量、睾丸功能、激素水平、蛋白表达和睾丸组织学变化的影响。淫羊藿苷补充改善了热应激下的精子质量,表现为总精子数和活力增加,精子畸形率降低(p < 0.01)。它还恢复了三磷酸腺苷酶(ATPase)活性(Na+-K+-ATPase、Mg2+-ATPase和Ca2+-ATPase)和血清激素水平(GnRH、LH和E2)(p < 0.01)。Western blot分析显示,淫羊藿苷上调了类固醇生成蛋白(STAR、17βHSD和CYP450)和紧密连接蛋白ZO-1(p < 0.01),同时下调了BAX表达(线粒体凋亡的关键调节因子)并增强了BCL-2表达(BCL-2家族的主要抗凋亡因子)(p < 0.01)。组织学评估表明,淫羊藿苷减轻了热诱导的生精小管损伤、上皮变薄和精原细胞退化。此外,分子对接分析证实淫羊藿苷与17βHSD之间具有强结合亲和力,由氢键和疏水相互作用介导。这些发现表明,淫羊藿苷可能通过调节睾酮合成、增强ATPase功能、恢复血睾屏障完整性和抑制凋亡来减轻睾丸热应激。剂量依赖性疗效(1.0 g/kg > 0.5 g/kg)支持淫羊藿苷作为改善暴露于高温环境中犬生殖健康的潜在治疗剂的可能。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
研究探究淫羊藿苷是否能够缓解犬睾丸热应激引起的生精功能障碍,并阐明其潜在机制。
核心机制
淫羊藿苷通过上调类固醇生成蛋白(STAR、17βHSD、CYP450)促进睾酮合成,增强ATPase活性,恢复血睾屏障完整性(上调ZO-1),并抑制细胞凋亡(下调BAX/上调BCL-2)来减轻热应激损伤。
主要证据
通过犬体内热应激模型,结合精子质量分析、激素水平检测、组织学检查、Western blot和分子对接实验,证明淫羊藿苷改善精子参数、恢复激素和酶活性、保护组织结构并调节相关蛋白表达。
研究意义
研究为淫羊藿苷在保护犬生殖健康方面的应用提供了科学依据,并提示其作为管理环境热应激相关生殖障碍潜在治疗剂的临床转化价值。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

建立犬睾丸热应激模型

模拟高温环境对睾丸的损伤,为评估淫羊藿苷的保护作用提供模型。

除阴性对照组外,所有犬接受45°C水浴处理,每天30分钟,连续4天(第18天至第21天),建立热应激模型。

2

淫羊藿苷干预处理

评估不同剂量的淫羊藿苷对热应激犬的保护作用。

每天分别给予0.5 g/kg(Icariin-L)和1.0 g/kg(Icariin-H)的淫羊藿苷添加到基础日粮中,持续14天正式实验期。

3

精子质量检测

评估淫羊藿苷对热应激犬精子数量、活力和形态的影响。

采集附睾精子,使用精子活力分析仪检测总精子数、精子活力和畸形率。

4

睾丸功能和激素水平检测

评估淫羊藿苷对睾丸ATPase活性和血清性激素水平的影响。

检测睾丸组织中Na+-K+-ATPase、Mg2+-ATPase和Ca2+-ATPase活性,以及血清中GnRH、LH和E2水平。

5

蛋白表达分析

验证淫羊藿苷对热应激相关蛋白(类固醇生成、紧密连接、凋亡)表达的影响。

通过Western blot检测STAR、17βHSD、CYP450、ZO-1、BAX和BCL-2的蛋白表达水平。

6

睾丸组织病理学检查

观察淫羊藿苷对热应激诱导的睾丸组织结构损伤的改善作用。

取睾丸组织固定、包埋、切片,进行H&E染色,在光镜下观察生精小管结构、上皮厚度和精原细胞变化。

7

分子对接分析

预测淫羊藿苷与17βHSD蛋白的结合亲和力和相互作用模式。

使用MOE 2019软件进行分子对接,分析结合能和作用力,并用PyMOL和Discovery Studio进行可视化。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

验证样本或模型特征
验证分子表达变化
验证机制链路

产品清单

实验环节名称品牌货号
淫羊藿苷Meilun Biotech Co., Ltd.B9520
超微量ATP酶试剂盒Enzyme-Linked Biotechnology Co., Ltd.ml093096
GnRH试剂盒Elabscience Biotechnology Co., Ltd.E-EL-0071
LH试剂盒Elabscience Biotechnology Co., Ltd.E-EL-M3053
E2试剂盒Elabscience Biotechnology Co., Ltd.E-OSEL-C0001
ZO-1抗体Thermo Fisher Scientific33-9100
BAX抗体Thermo Fisher ScientificMA5-14003
BCL-2抗体Thermo Fisher Scientific13-8800
STAR抗体Thermo Fisher ScientificMA5-47013
17βHSD抗体Thermo Fisher ScientificMA5-25937
CYP450抗体Thermo Fisher ScientificPA1-343
HT-Motility™Hamilton Thorne, Inc--
旋转切片机Leica MicrosystemsRM2235
光学显微镜Leica MicrosystemsDM4000B
RIPA裂解液Solarbio Life SciencesR0020
蛋白酶抑制剂混合物Roche Diagnostics04693132001
BCA测定Pierce™, Thermo Fisher Scientific23225
PVDF膜MilliporeSigmaIPVH00010
SuperSignal™ West Femto化学发光底物Thermo Fisher Scientific34095
FUSION FX Spectra成像系统Vilber Lourmat--
β-肌动蛋白抗体ABclonalAC004
ChemOffice 20.0PerkinElmer, Inc.--
PyMOL 2.6.0----
MOE 2019Dassault Systèmes BIOVIA--
GraphPad Prism 8.0GraphPad Software, LLC--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
动物模型
犬种:成年雄性比格犬;体重:9.82±0.73 kg;每组6只;热应激模型:45°C水浴,30分钟/天,连续4天
阅读提示:Materials and Methods, 2.2 Experimental design and diet composition
药物干预
淫羊藿苷剂量:0.5 g/kg和1.0 g/kg;给药方式:通过日粮补充;实验周期:21天(7天预饲+14天正式实验)
阅读提示:Materials and Methods, 2.2 Experimental design and diet composition
精子质量检测
精子活力分析仪:HT-Motility™;检测指标:总精子数、活力、畸形率
阅读提示:Materials and Methods, 2.4 Sperm quality, testicular function, and hormone level determination
睾丸功能与激素检测
ATPase活性检测:超微量ATPase试剂盒;激素检测:GnRH、LH、E2试剂盒;血清样本处理:离心2,500 rpm,10分钟
阅读提示:Materials and Methods, 2.4 Sperm quality, testicular function, and hormone level determination
蛋白表达分析
抗体稀释比:ZO-1、BAX、BCL-2、17βHSD、CYP450均为1:1000,STAR为1:800;内参:β-actin (1:5000);上样量:30 μg/孔
阅读提示:Materials and Methods, 2.5 Testicular histopathology and protein expression analysis
组织病理学
固定:4%多聚甲醛,4°C,48小时;切片厚度:5 μm;染色:H&E
阅读提示:Materials and Methods, 2.5 Testicular histopathology and protein expression analysis