细胞增殖与凋亡检测
验证Tan IIA对CRC细胞增殖和凋亡的影响
OUMS23细胞用不同浓度Tan IIA处理48小时，EdU染色检测增殖，Annexin V/PI双染流式检测凋亡。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
丹参酮IIA通过PI3K/AKT/mTOR通路抑制SLC7A11表达诱导结直肠癌细胞铁死亡
Tanshinone IIA induces ferroptosis in colorectal cancer cells through the suppression of SLC7A11 expression via the PI3K/AKT/mTOR pathway.
实验完整度
中包含细胞实验（增殖、凋亡、铁死亡指标）和动物模型（皮下移植瘤）验证，但仅用一种细胞系，机制验证依赖SLC7A11质粒回补。
主要模型
人结直肠癌细胞系OUMS23 BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型
重点核对
Tan IIA浓度梯度（0, 5, 10, 20 μM）处理OUMS23细胞48小时 SLC7A11质粒转染以恢复SLC7A11表达 体内实验中Tan IIA剂量为50 mg/kg，每隔一天腹腔注射 对照组设置：Control、Tan IIA、Tan IIA+对照质粒、Tan IIA+SLC7A11质粒
摘要
背景：结直肠癌（CRC）是一种消化系统恶性肿瘤，发病率和死亡率高。丹参酮IIA（Tan IIA）在多种癌细胞中发挥抗癌作用。在此，我们旨在阐明Tan IIA在CRC中的治疗效果和潜在机制。方法：用0、5、10或20 μM Tan IIA处理OUMS23细胞，并给CRC小鼠施用20 μM Tan IIA加SLC7A11质粒。分别采用Edu和流式细胞术分析检测细胞增殖和凋亡。使用Iron Assay试剂盒测定细胞内和肿瘤组织中的总铁和Fe2+水平。通过流式细胞术评估脂质活性氧（ROS）的产生。通过逆转录定量PCR（RT-qPCR）、Western blot分析和免疫组织化学（IHC）分析SLC7A11表达。通过Western blotting测定磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/AKT/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路的激活状态。结果：Tan IIA以剂量依赖性方式抑制CRC增殖。此外，Tan IIA抑制OUMS23细胞和肿瘤组织中SLC7A11的表达。功能实验表明，Tan IIA诱导CRC细胞凋亡、铁死亡和细胞内及肿瘤组织中ROS释放，而SLC7A11质粒转染可逆转这些效应。此外，SLC7A11质粒逆转了Tan IIA对CRC皮下肿瘤体积和重量的影响。进一步实验表明，SLC7A11质粒消除了Tan IIA对PI3K/AKT/mTOR通路的影响，磷酸化（p）-AKT和p-mTOR表达增加，以及p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR比值增加证实了这一点。结论：Tan IIA通过PI3K/AKT/mTOR通路抑制SLC7A11表达诱导CRC铁死亡。因此，Tan IIA可能成为治疗CRC的有效药物。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 丹参酮IIA是否通过PI3K/AKT/mTOR通路抑制SLC7A11表达诱导结直肠癌细胞铁死亡？
- 核心机制
- Tan IIA通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路下调SLC7A11表达，从而诱导结直肠癌细胞铁死亡。
- 主要证据
- 体外实验显示Tan IIA剂量依赖性抑制OUMS23细胞增殖、诱导凋亡和铁死亡（总铁、Fe2+、脂质ROS增加），并降低SLC7A11表达和p-AKT/p-mTOR水平；体内实验中Tan IIA减小肿瘤体积和重量，降低肿瘤组织中铁和ROS水平，而SLC7A11质粒转染逆转这些效应。
- 研究意义
- 为Tan IIA治疗CRC提供实验依据，提示Tan IIA可能成为CRC临床治疗的候选药物。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
铁死亡指标检测
验证Tan IIA是否诱导CRC细胞铁死亡
检测细胞内总铁、Fe2+和脂质ROS水平。
SLC7A11表达及功能验证
验证Tan IIA对SLC7A11表达的抑制及其在铁死亡中的作用
通过RT-qPCR和Western blot检测SLC7A11表达，并转染SLC7A11质粒观察对铁死亡指标的影响。
PI3K/AKT/mTOR通路检测
验证Tan IIA对PI3K/AKT/mTOR通路的影响及SLC7A11的调控作用
Western blot检测p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR蛋白水平，计算p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR比值。
体内抗肿瘤效果评估
验证Tan IIA在体内的抗肿瘤作用及SLC7A11的逆转效应
建立OUMS23细胞皮下移植瘤模型，分组处理，测量肿瘤体积和重量，检测肿瘤组织中铁死亡指标、SLC7A11表达和通路蛋白。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | ASPEN | AS1044 | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| 药物处理 | 丹参酮IIA | MedChemExpress | HY-N0135 |
| 细胞增殖检测 | EdU | -- | -- |
| Apollo反应试剂盒 | -- | -- | |
| 细胞毒性检测 | MTT溶液 | -- | -- |
| 细胞凋亡检测 | Annexin V/PI凋亡检测试剂盒 | Beyotime | -- |
| 铁死亡检测 | 铁检测试剂盒 | Elabscience | -- |
| 脂质ROS检测 | DCFH-DA探针 | -- | -- |
| RNA提取 | TRIpure总RNA提取试剂 | ELK Biotechnology | EP013 |
| cDNA合成 | EntiLink™第一链cDNA合成预混液 | ELK Biotechnology | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | ASPEN | AS1004 |
| SDS-PAGE凝胶 | ASPEN | AS1012 | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| 增强化学发光液 | ASPEN | AS1059 | |
| SLC7A11抗体 | Abcam | ab175186 | |
| p-AKT抗体 | CST | 9018 | |
| AKT抗体 | CST | 2938 | |
| p-mTOR抗体 | CST | 5536 | |
| mTOR抗体 | CST | 2983 | |
| β-actin抗体 | Beijing TDY Biotech | TDY051 | |
| 细胞转染 | Lipofectamine® 3000转染试剂 | Thermo | -- |
| IHC | SLC7A11抗体（IHC） | Triple Eagle | 26864-1-AP |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与处理 | 细胞系：OUMS23；培养基：DMEM+5%FBS+1%青链霉素；处理浓度：0,5,10,20 μM；处理时间：48小时 阅读提示：Materials and methods中的Cell culture部分 |
| 细胞转染 | 转染试剂：Lipofectamine 3000；质粒：对照或SLC7A11质粒；转染时间：48小时 阅读提示：Materials and methods中的Cell transfection部分 |
| 体内实验 | 动物：雄性BALB/c裸鼠，4-6周龄，每组6只；细胞注射量：2×10^6；分组：Control、Tan IIA(50 mg/kg)、Tan IIA+对照质粒、Tan IIA+SLC7A11质粒；给药方式：腹腔注射隔天一次；实验周期：接种后7天开始给药，28天处死 阅读提示：Materials and methods中的Experimental animals部分 |
| Western blot | 一抗：SLC7A11(1:1000, ab175186)，p-AKT(1:1000, #9018)，AKT(1:2000, #2938)，p-mTOR(1:500, #5536)，mTOR(1:1000, #2983)，β-actin(1:10000, TDY051)；二抗孵育2小时 阅读提示：Materials and methods中的Western blot assay部分 |