整合单细胞和批量RNA测序分析建立癌症相关成纤维细胞相关特征用于预测神经母细胞瘤的预后和治疗反应

Integrated single-cell and bulk RNA sequencing analysis establishes a cancer associated fibroblast-related signature for predicting prognosis and therapeutic responses in neuroblastoma.

作者信息Zhiyao Cao, Qi Wang, Yali Han, Jianwei Lin, Qi Wu, Chencheng Xu, Jingchun Lv, Lei Zhang, Hongxiang Gao, Dapeng Jiang
PMID40591170
发布时间2025-07-01
DOI10.1007/s12672-025-03023-y

实验完整度

基于公共测序数据构建预后模型,并通过免疫组化验证蛋白表达,但未进行体外或体内功能实验,机制验证不足。

主要模型

神经母细胞瘤患者肿瘤组织(石蜡包埋切片) GSE137804 scRNA-seq数据集(8个NB样本) SEQC队列(498个NB样本)

重点核对

CAF风险评分计算公式中的八个基因及其系数 免疫组化所用抗体(SSR3、CSRP2、ZEB2、PTN、FKBP10、PPFIBP1)的稀释比例(1:200) 免疫组化染色条件(一抗4℃孵育过夜,二抗室温30分钟,DAB染色10分钟) 预后模型验证的四个队列(SEQC验证、SEQC总体、TARGET NBL、E-MTAB-8248)

摘要

背景:癌症相关成纤维细胞(CAFs)在神经母细胞瘤(NB)的生长、侵袭、转移和耐药中发挥重要作用。本研究旨在通过单细胞RNA测序(scRNA-seq)和批量RNA测序(RNA-seq)构建CAF相关预后模型,并确定NB患者的免疫状态。方法:从基因表达综合(GEO)数据库获取的NB scRNA-seq数据用于识别细胞亚群。从GEO、癌症基因组图谱(TCGA)和ArrayExpress数据库下载批量基因表达数据,并使用单变量Cox和最小绝对收缩和选择算子(LASSO)分析构建预后模型。研究了高风险和低风险组之间免疫浸润、治疗反应和信号通路的差异。最后,进行免疫组织化学评估蛋白质表达,并构建基于风险特征和临床特征的列线图。结果:整合八个NB样本的scRNA-seq数据,鉴定出253个CAF标记基因。基于GEO数据建立了八基因预后CAF相关特征。CAF模型与肿瘤中的免疫浸润、药物反应和活跃信号通路密切相关。单变量和多变量Cox回归分析验证了CAF模型作为独立的预后指标,并构建了整合临床特征和CAF相关风险特征的列线图用于临床预测。结论:CAF相关特征可有效预测NB的预后,并为抗CAF免疫治疗策略提供新的基因组证据。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
能否通过整合单细胞和批量RNA测序数据构建癌症相关成纤维细胞相关基因特征,以预测神经母细胞瘤患者的预后和治疗反应?
核心机制
CAF通过形成致密细胞外基质、分泌细胞因子和与肿瘤相关巨噬细胞相互作用,促进肿瘤进展并形成免疫抑制微环境,导致免疫治疗反应差和化疗耐药。
主要证据
基于scRNA-seq识别253个CAF标记基因,构建八基因预后模型,在多个队列中验证了其预后预测能力;免疫组化验证了风险基因(FKBP10、CSRP2、SSR3)在肿瘤基质中高表达,保护基因(PPFIBP1、ZEB2、PTN)低表达;TIDE分析显示低CAF风险患者对免疫治疗更敏感。
研究意义
CAF相关特征可作为神经母细胞瘤的独立预后生物标志物,并为抗CAF免疫治疗策略提供基因组证据。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

单细胞RNA测序数据分析和细胞亚群鉴定

识别神经母细胞瘤肿瘤微环境中的细胞类型,特别是成纤维细胞亚群。

从GEO数据库获取GSE137804 scRNA-seq数据,随机选取8个样本,经过质量控制和批次效应校正,使用t-SNE聚类,通过SingleR和文献标记基因注释,鉴定出7种细胞类型,包括成纤维细胞。

2

CAF相关差异表达基因鉴定和功能富集分析

鉴定成纤维细胞亚群中差异表达的基因,并探索其功能富集。

对成纤维细胞亚群进行差异表达分析,筛选出253个CAF候选基因,并进行GO和KEGG富集分析。

3

构建八基因CAF相关预后模型

筛选与总生存期相关的CAF基因,构建风险评分模型。

使用SEQC训练队列进行单变量Cox回归和LASSO回归分析,筛选出8个预后基因(HES4、FKBP10、PPFIBP1、ZEB2、CSRP2、PTN、SSR3、NEAT1),构建风险评分公式。

4

免疫组化验证蛋白表达

验证风险基因和保护基因在神经母细胞瘤组织中的蛋白表达水平。

对上海儿童医学中心收集的NB组织石蜡切片进行免疫组化染色,检测六个基因的蛋白表达。

5

预后模型验证和独立预后分析

在多个外部队列中验证CAF风险模型的预后预测能力,并评估其作为独立预后因素的价值。

在SEQC验证、SEQC总体、TARGET NBL和E-MTAB-8248队列中,根据风险评分中位数分组,进行Kaplan-Meier生存分析和ROC曲线分析,并通过单变量和多变量Cox回归分析评估独立性。

6

免疫浸润和药物反应分析

探索CAF风险评分与肿瘤免疫微环境、化疗和免疫治疗反应的关系。

使用ssGSEA、ESTIMATE、EPIC和MCPcounter算法评估免疫细胞浸润,使用oncoPredict预测化疗药物敏感性,使用TIDE预测免疫治疗反应。

7

构建并验证列线图

结合CAF风险评分和临床特征构建预测总生存期的列线图。

基于SEQC总体队列,使用单变量和多变量Cox回归筛选独立预后因素(CAF风险评分、年龄、MYCN状态、INSS分期),构建列线图,并通过ROC曲线和校准曲线验证其预测性能。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
抗SSR3抗体Affinity BiosciencesDF2778
抗CSRP2抗体ElabscienceE-AB-53072
抗ZEB2抗体ElabscienceE-AB-10589
抗PTN抗体Proteintech27117-1-AP
抗FKBP10抗体Proteintech12172-1-AP
抗PPFIBP1抗体Proteintech13961-1-AP
二抗DakoK5007

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
单细胞RNA测序数据处理
样本来源和数量(8个NB样本)、质量控制标准(nFeature_RNA、nCount_RNA、percentage.mt)、批次效应校正方法(harmony)、降维参数(前18个主成分)
阅读提示:Methods: ScRNA-seq data processing and analysis
CAF风险模型构建
训练队列的划分比例(7:3)、单变量Cox回归的筛选阈值(P < 0.001)、LASSO回归的参数选择(lambda)
阅读提示:Methods: Prognostic model construction and validation; Figure 2A-B
免疫组化验证
抗体稀释比例(1:200)、孵育时间(一抗4℃过夜,二抗室温30分钟)、DAB染色时间(10分钟)
阅读提示:Methods: Tissue collection and immunohistochemical (IHC) analysis
药物反应预测
预测算法(oncoPredict)、药物列表(顺铂、长春新碱、依托泊苷、多柔比星、拓扑替康、环磷酰胺)
阅读提示:Methods: Chemotheraeutic sensitivity and immunotherapy response predictions
免疫治疗反应预测
TIDE算法应用、免疫治疗反应预测的分组标准
阅读提示:Methods: Chemotheraeutic sensitivity and immunotherapy response predictions; Figure 6D-F