单细胞RNA测序数据分析和细胞亚群鉴定
识别神经母细胞瘤肿瘤微环境中的细胞类型,特别是成纤维细胞亚群。
从GEO数据库获取GSE137804 scRNA-seq数据,随机选取8个样本,经过质量控制和批次效应校正,使用t-SNE聚类,通过SingleR和文献标记基因注释,鉴定出7种细胞类型,包括成纤维细胞。
Integrated single-cell and bulk RNA sequencing analysis establishes a cancer associated fibroblast-related signature for predicting prognosis and therapeutic responses in neuroblastoma.
基于公共测序数据构建预后模型,并通过免疫组化验证蛋白表达,但未进行体外或体内功能实验,机制验证不足。
神经母细胞瘤患者肿瘤组织(石蜡包埋切片) GSE137804 scRNA-seq数据集(8个NB样本) SEQC队列(498个NB样本)
CAF风险评分计算公式中的八个基因及其系数 免疫组化所用抗体(SSR3、CSRP2、ZEB2、PTN、FKBP10、PPFIBP1)的稀释比例(1:200) 免疫组化染色条件(一抗4℃孵育过夜,二抗室温30分钟,DAB染色10分钟) 预后模型验证的四个队列(SEQC验证、SEQC总体、TARGET NBL、E-MTAB-8248)
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
识别神经母细胞瘤肿瘤微环境中的细胞类型,特别是成纤维细胞亚群。
从GEO数据库获取GSE137804 scRNA-seq数据,随机选取8个样本,经过质量控制和批次效应校正,使用t-SNE聚类,通过SingleR和文献标记基因注释,鉴定出7种细胞类型,包括成纤维细胞。
鉴定成纤维细胞亚群中差异表达的基因,并探索其功能富集。
对成纤维细胞亚群进行差异表达分析,筛选出253个CAF候选基因,并进行GO和KEGG富集分析。
筛选与总生存期相关的CAF基因,构建风险评分模型。
使用SEQC训练队列进行单变量Cox回归和LASSO回归分析,筛选出8个预后基因(HES4、FKBP10、PPFIBP1、ZEB2、CSRP2、PTN、SSR3、NEAT1),构建风险评分公式。
验证风险基因和保护基因在神经母细胞瘤组织中的蛋白表达水平。
对上海儿童医学中心收集的NB组织石蜡切片进行免疫组化染色,检测六个基因的蛋白表达。
在多个外部队列中验证CAF风险模型的预后预测能力,并评估其作为独立预后因素的价值。
在SEQC验证、SEQC总体、TARGET NBL和E-MTAB-8248队列中,根据风险评分中位数分组,进行Kaplan-Meier生存分析和ROC曲线分析,并通过单变量和多变量Cox回归分析评估独立性。
探索CAF风险评分与肿瘤免疫微环境、化疗和免疫治疗反应的关系。
使用ssGSEA、ESTIMATE、EPIC和MCPcounter算法评估免疫细胞浸润,使用oncoPredict预测化疗药物敏感性,使用TIDE预测免疫治疗反应。
结合CAF风险评分和临床特征构建预测总生存期的列线图。
基于SEQC总体队列,使用单变量和多变量Cox回归筛选独立预后因素(CAF风险评分、年龄、MYCN状态、INSS分期),构建列线图,并通过ROC曲线和校准曲线验证其预测性能。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 单细胞RNA测序数据处理 | 样本来源和数量(8个NB样本)、质量控制标准(nFeature_RNA、nCount_RNA、percentage.mt)、批次效应校正方法(harmony)、降维参数(前18个主成分) 阅读提示:Methods: ScRNA-seq data processing and analysis |
| CAF风险模型构建 | 训练队列的划分比例(7:3)、单变量Cox回归的筛选阈值(P < 0.001)、LASSO回归的参数选择(lambda) 阅读提示:Methods: Prognostic model construction and validation; Figure 2A-B |
| 免疫组化验证 | 抗体稀释比例(1:200)、孵育时间(一抗4℃过夜,二抗室温30分钟)、DAB染色时间(10分钟) 阅读提示:Methods: Tissue collection and immunohistochemical (IHC) analysis |
| 药物反应预测 | 预测算法(oncoPredict)、药物列表(顺铂、长春新碱、依托泊苷、多柔比星、拓扑替康、环磷酰胺) 阅读提示:Methods: Chemotheraeutic sensitivity and immunotherapy response predictions |
| 免疫治疗反应预测 | TIDE算法应用、免疫治疗反应预测的分组标准 阅读提示:Methods: Chemotheraeutic sensitivity and immunotherapy response predictions; Figure 6D-F |