患者样本病理特征评估
比较ECRSwNP、nECRSwNP和对照组鼻黏膜中焦亡相关标志物的表达和炎性细胞浸润。
对鼻息肉组织和对照黏膜进行H&E染色和IHC染色，检测NLRP3、IL-1β；IF染色检测cleaved GSDMD和Caspase-1。
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细胞焦亡激活损害慢性鼻窦炎伴鼻息肉鼻腔上皮基底细胞分化
Activation of pyroptosis impairs basal cell differentiation in the nasal epithelium in chronic rhinosinusitis with nasal polyps.
实验完整度
中包含患者样本的IHC和IF检测、原代细胞和细胞系的体外功能实验、Western blot和RT-qPCR验证，以及RNA-seq通路分析，但缺乏体内模型验证。
主要模型
原代人鼻上皮细胞（HNEpCs） RPMI-2650基底细胞系 CRSwNP患者鼻组织样本 CRSwNP患者外周血清
重点核对
血清处理浓度和时间：稀释血清处理72小时 细胞因子处理浓度：IL-5和IL-17A均为100 ng/mL处理24小时或72小时 焦亡抑制剂DMF浓度：50 μM 抗体信息：NLRP3 (19771-1-AP)，IL-1β (ab283818)，Caspase-1 (2225T)，cleaved Caspase-1 (4199T)，GSDMD (20770-1-AP)
摘要
慢性鼻窦炎伴鼻息肉（CRSwNP）是一种慢性炎症性鼻窦疾病，分为嗜酸性粒细胞性CRSwNP（ECRSwNP）和非嗜酸性粒细胞性CRSwNP（nECRSwNP），影响2-4%的人口。细胞焦亡与CRSwNP的发病机制有关，尽管驱动细胞焦亡的潜在分子机制及其在CRSwNP发生和发展中的作用仍不完全清楚。收集了ECRSwNP和nECRSwNP的鼻组织标本，并通过苏木精-伊红染色、焦亡相关标志物（包括NLRP3和IL-1β）的免疫组织化学（IHC）染色进行分析。使用免疫荧光（IF）染色评估裂解的gasdermin D（GSDMD）和Caspase-1的表达。分离并培养原代人鼻上皮细胞（HNEpCs）以在体外研究炎症机制。采用蛋白质印迹和逆转录定量PCR（RT-qPCR）定量炎症小体相关基因和蛋白质的表达。进行RNA测序（RNA-seq）以使用DESeq2和DAVID进行功能注释，鉴定差异表达基因和富集通路。本研究表明，在ECRSwNP和nECRSwNP患者的人样本中存在焦亡特征，表现为NLRP3和IL-1β表达升高，且在nECRSwNP样本中观察到比ECRSwNP样本更强的信号。此外，在外周静脉血清中鉴定出IL-5和IL-17A分别是ECRSwNP和nECRSwNP中焦亡的关键触发因素。此外，焦亡的激活破坏了基底细胞的分化，有利于杯状细胞分化，这是CRSwNP的主要标志。抑制焦亡通过抑制炎症和代谢通路恢复基底细胞分化的平衡。本研究结果强调焦亡是CRSwNP的关键病理驱动因素，并提示靶向焦亡可能提供恢复上皮稳态和缓解疾病症状的新治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 细胞焦亡在慢性鼻窦炎伴鼻息肉（CRSwNP）发病机制中的作用，以及不同细胞因子环境如何通过炎症小体介导的通路影响上皮细胞行为。
- 核心机制
- IL-5和IL-17A分别触发ECRSwNP和nECRSwNP中的细胞焦亡，焦亡的激活通过抑制炎症和代谢通路破坏基底细胞分化，促进杯状细胞分化。
- 主要证据
- 患者样本中NLRP3、IL-1β、cleaved GSDMD和Caspase-1表达升高，且nECRSwNP高于ECRSwNP；血清和细胞因子处理诱导基底细胞焦亡；焦亡抑制剂DMF恢复分化标志物表达（如CLCA1下调、DNAI2上调）；RNA-seq显示相关通路改变。
- 研究意义
- 靶向焦亡可能为恢复上皮稳态和缓解CRSwNP症状提供新的治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
患者血清诱导基底细胞焦亡
验证CRSwNP患者外周血清是否能诱导基底细胞焦亡。
用来自ECRSwNP或nECRSwNP患者的稀释血清处理RPMI-2650细胞72小时，通过免疫细胞化学和Western blot检测焦亡标志物（cleaved GSDMD、Caspase-1、NLRP3）。
细胞因子IL-5和IL-17A诱导焦亡表型
确定IL-5和IL-17A是否分别触发ECRSwNP和nECRSwNP的焦亡，以及焦亡抑制剂DMF的作用。
用IL-5或IL-17A处理HNEpCs细胞24小时，检测焦亡标志物；同时使用DMF共处理，观察抑制效果。
转录组分析
揭示IL-5和IL-17A刺激后基底细胞中差异表达基因和富集通路，以及DMF处理后的逆转情况。
对IL-5或IL-17A处理的RPMI-2650细胞进行RNA-seq，并在DMF处理后再次分析，使用DESeq2和DAVID进行差异表达和通路富集分析。
评估基底细胞分化标志物
验证焦亡激活对基底细胞分化方向的影响以及抑制焦亡的恢复作用。
通过RT-qPCR检测杯状细胞标志物（CLCA1、MUC5AC）和纤毛细胞标志物（DNAI2、FOXJ1）的mRNA表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫组织化学/免疫荧光 | 抗IL-1β抗体 | Abcam | ab283818 |
| 蛋白质印迹 | 抗GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-1g |
| 蛋白质印迹/免疫组织化学 | 抗NLRP3抗体 | Proteintech | 19771-1-AP |
| 抗GSDMD抗体 | Proteintech | 20770-1-AP | |
| 蛋白质印迹 | 抗Caspase-1抗体 | Cell Signaling Technology | 2225T |
| 抗裂解Caspase-1抗体 | Cell Signaling Technology | 4199T | |
| 免疫荧光 | 驴抗兔IgG（H+L）交叉吸附二抗，DyLight 488 | Invitrogen | SA5-10038 |
| 驴抗鼠IgG（H+L）交叉吸附二抗，DyLight 650 | Invitrogen | SA5-10169 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| 免疫组织化学 | 山羊抗兔IgG（H+L）（过氧化物酶/HRP偶联） | Elabscience | E-AB-1003 |
| 山羊抗鼠IgG（H+L）（过氧化物酶/HRP偶联） | Elabscience | E-AB-1001 | |
| 细胞因子处理 | 重组人IL-5蛋白 | 上海翊圣生物科技有限公司 | 90106ES10 |
| 重组人IL-17A蛋白 | PeproTech | 200-17 | |
| 蛋白质印迹 | ECL底物试剂盒 | 大连美仑生物技术有限公司 | MA0186-2 |
| 细胞培养 | 分散酶II | Stem Cell Technology | -- |
| 胰蛋白酶 | Invitrogen | -- | |
| Transwell小室 | Corning | -- | |
| I型胶原 | Sigma | -- | |
| DMEM培养基 | Sigma | -- | |
| 胎牛血清 | Invitrogen | -- | |
| 支气管上皮生长培养基 | -- | -- | |
| DMEM/F12培养基 | Sigma | -- | |
| RPMI-1640培养基 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 胰蛋白酶（2.5%） | Gibco | -- | |
| 细胞因子处理 | 富马酸二甲酯 | Sigma | -- |
| 蛋白质印迹 | RIPA裂解液 | Yeasen | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime Biotechnology | -- | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| SDS-PAGE凝胶（4-20%） | -- | -- | |
| ChemiDoc XRS+成像系统 | Bio-Rad Laboratories | -- | |
| Image Lab软件6.0 | Bio-Rad Laboratories | -- | |
| RT-qPCR | 总RNA提取试剂 | Vazyme Biotech | -- |
| HiScript III RT SuperMix（qPCR用） | Vazyme Biotech | -- | |
| Taq Pro Universal SYBR qPCR预混液 | Vazyme Biotech | -- | |
| RNA-seq | Agilent 2100生物分析仪 | Agilent Technologies | -- |
| VAHTS Universal V8 RNA-seq文库制备试剂盒 | Vazyme Biotech | NRM605-02 | |
| VAHTS RNA接头套装8（MGI用） | Vazyme Biotech | NM208-01 | |
| Qubit 4.0荧光计 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| MGI-SEQ 2000平台 | BGI Group | -- | |
| 影像学检查 | Discovery CT750 HD | GE Healthcare | -- |
| 免疫组织化学/免疫荧光 | 牛血清白蛋白 | Yeasen | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 患者样本收集 | 样本类型：鼻息肉组织和中鼻甲黏膜；患者分组：ECRSwNP和nECRSwNP；样本量：31例CRSwNP（16例ECRSwNP、15例nECRSwNP）和13例对照；排除标准：3个月内使用抗生素或口服皮质类固醇等。 阅读提示：Materials and methods, Patients 和 Human specimen collection |
| 细胞培养与处理 | HNEpCs的分离和培养方法；RPMI-2650细胞培养条件；血清处理浓度和时间：稀释血清处理72小时；细胞因子浓度：IL-5和IL-17A均为100 ng/mL；DMF浓度：50 μM；处理时间：24小时或72小时。 阅读提示：Materials and methods, Cell culture 和 Stimulation assays |
| 焦亡标志物检测 | 抗体信息：NLRP3 (19771-1-AP)，IL-1β (ab283818)，Caspase-1 (2225T)，cleaved Caspase-1 (4199T)，GSDMD (20770-1-AP)；稀释度：IHC 1:500，Western blot一抗稀释度如NLRP3 1:1000等。 阅读提示：Materials and methods, Reagents, Immunohistochemical and immunofluorescent staining, Western blotting |
| RT-qPCR | 引物序列；内参基因：GAPDH；循环条件：95°C 3分钟，40个循环95°C 15秒，60°C 30秒。 阅读提示：Materials and methods, RT-qPCR |
| RNA-seq | 文库制备试剂盒和平台：VAHTS Universal V8 RNA-Seq Library Prep kit，MGI-SEQ 2000平台；比对和差异表达分析软件：HISAT2、featureCounts、DESeq2；功能注释：DAVID。 阅读提示：Materials and methods, RNA-sequencing (seq) |