一种具有抗菌、抗氧化和成骨性能的pH敏感型CuHP复合水凝胶用于治疗糖尿病牙周炎

A pH-sensitive CuHP composite hydrogel featuring antibacterial, antioxidant and osteogenic properties for treating diabetic periodontitis.

作者信息Xianwen Lu, Sitong Hu, Zhaowenbin Zhang, Jing Bao, Bangping Cao, Jian Xie, Jiang Chang, Chen Yang, Xiaohong Wang, Jiansheng Su
PMID40979829
发布时间2025-06-23
DOI10.1093/rb/rbaf065

实验完整度

包含体外细胞实验(BMSCs)、抗菌实验、RNA-seq、大鼠DP模型、micro-CT及组织学分析,且具备功能与机制验证。

主要模型

大鼠骨髓间充质干细胞 大鼠2型糖尿病牙周炎模型 Aggregatibacter actinomycetemcomitans

重点核对

SA/CuHP水凝胶中CuHP浓度为1% (w/v) H2O2浓度500μM及处理时间3小时 pH 5酸性条件用于POD样活性,pH 7.4用于CAT样活性 大鼠DP模型:4周龄雄性SD大鼠,STZ诱导糖尿病,丝线结扎3周,治疗4周 样本量n=6每组

摘要

Periodontitis, a chronic inflammatory disorder primarily induced by bacterial infection and exacerbated by excessive oxidative stress, leads to the destruction of alveolar bone. Diabetes mellitus intensifies this oxidative stress in periodontal tissues and disrupts the oral microbiome, thereby aggravating periodontal conditions and complicating the management of periodontitis. The development of materials that possess comprehensive therapeutic effects, including antibacterial, antioxidant and osteogenic properties, for the treatment of diabetic periodontitis (DP) remains at the forefront of research. In this study, we introduced a copper hydrogen phosphate (CuHP) composite hydrogel, which exhibited multi-enzymatic activities at varying pH levels. This hydrogel was synthesized by encapsulating CuHP within a commercially available sodium alginate (SA) matrix. In vitro analyses explored the pH-responsive enzymatic activities, biocompatibility and the antioxidant, osteogenic and antibacterial properties of the resultant SA/CuHP composite hydrogel. At neutral pH, the hydrogel primarily exhibited catalase-like activity, providing it with antioxidant capabilities that reduced the inhibitory effects of oxidative stress on osteogenesis in bone marrow mesenchymal stem cells. In mildly acidic conditions, the hydrogel displayed peroxidase-like activity, catalysing the production of more potent reactive oxygen species and exhibiting significant antibacterial efficacy against Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Furthermore, the SA/CuHP hydrogel continuously released copper ions, which synergistically enhance its osteogenic and antimicrobial efficacies. In vivo studies demonstrated that this composite hydrogel significantly inhibited bacterial growth and promoted bone regeneration in a rat model of DP. These findings suggest that the SA/CuHP hydrogel holds substantial potential for the treatment of periodontitis in patients with diabetes.

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
开发一种具有抗菌、抗氧化和成骨性能的多功能材料,用于治疗糖尿病牙周炎。
核心机制
SA/CuHP水凝胶在中性pH下通过CAT样活性清除H2O2,减轻氧化应激,并释放铜离子,激活PI3K-AKT、ECM-受体相互作用和钙信号通路,促进成骨分化;在酸性pH下通过POD样活性催化H2O2生成•OH,发挥抗菌作用。
主要证据
体外BMSCs实验显示SA/CuHP减轻氧化应激、促进增殖和成骨分化;RNA-seq显示成骨相关基因上调;抗菌实验显示对A.a的抑制率75.7%;大鼠DP模型中micro-CT和组织学显示骨吸收减少、牙周组织修复。
研究意义
本研究提供了一种pH响应性多功能水凝胶,整合抗菌、抗氧化和成骨功能,为糖尿病牙周炎的治疗提供潜在策略。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

材料合成与表征

制备CuHP和SA/CuHP水凝胶,并验证其结构和多酶活性。

通过铜硫酸盐和PBS反应合成CuHP,将其不同浓度包封于海藻酸钠水凝胶中,用SEM、XRD、元素映射、力学测试、流变学等表征;评估POD和CAT样活性及铜离子释放。

2

体外细胞相容性与抗氧化评价

评估SA/CuHP水凝胶的细胞相容性和抗氧化能力。

将大鼠BMSCs与不同浓度水凝胶共培养,CCK8检测增殖;用H-DMEM和H2O2建立氧化应激模型,检测细胞活力、ROS水平、活死染色和迁移。

3

体外成骨分化评价

验证SA/CuHP水凝胶在氧化应激下促进BMSCs成骨分化。

在氧化应激条件下进行成骨诱导,通过ALP染色、ARS染色、RUNX2免疫荧光、qRT-PCR和Western blot检测成骨标志物。

4

转录组学机制分析

探究SA/CuHP水凝胶促进成骨的潜在分子通路。

对H2O2组和SA/CuHP组BMSCs进行RNA-seq,分析差异表达基因,并进行GO和KEGG富集。

5

体外抗菌评价

评估SA/CuHP水凝胶在酸性条件下对伴放线聚集杆菌的抗菌效果。

以A.a为模型,在pH5条件下培养,平板计数、活死染色和SEM观察抗菌效果。

6

体内疗效评价

在糖尿病牙周炎大鼠模型中评估SA/CuHP水凝胶的抗菌和骨再生效果。

建立DP大鼠模型,局部注射水凝胶,检测牙周细菌数量,micro-CT分析骨量,HE和Masson染色观察组织形态。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
硫酸铜Macklin Co., Ltd.--
氯化钙Aladdin Co., Ltd.--
αMEM培养基HyClone Co., Ltd.--
高糖DMEM培养基HyClone Co., Ltd.--
磷酸盐缓冲液HyClone Co., Ltd.--
青霉素/链霉素HyClone Co., Ltd.--
胎牛血清ExCell Bio Co., Ltd.--
扫描电子显微镜HITACHISU8010
X射线衍射仪BrukerD8 ADVANCE
元素映射设备BrukerDimension ICON
力学测试仪INSTRON5982
流变仪Thermo FisherMars40
过氧化氢酶检测试剂盒(可见光)Nanjing Jiancheng--
酶标仪BioTekSynergy HIM
电感耦合等离子体质谱Agilent7850
2,7-二氯荧光素二乙酸酯探针----
Calcein-AM/PI试剂盒Beyotime--
L-抗坏血酸Sigma--
地塞米松Sigma--
β-甘油磷酸Sigma--
ALP染色试剂盒Beyotime--
茜素红溶液OriCell--
RUNX2一抗Proteintech--
二抗Proteintech--
Trizol试剂TaKaRa--
PrimeScript逆转录试剂盒TaKaRa--
SYBR Green PCR预混液Yeasen--
实时荧光定量PCR仪Roche--
RIPA裂解液Beyotime--
BCA蛋白定量试剂盒Beyotime--
硝酸纤维素膜Millipore--
脱脂牛奶Elabscience--
GAPDH抗体Cell Signaling--
RUNX2抗体Abcam--
OSX抗体Abcam--
化学发光成像仪Tanon4600
厌氧基础肉汤QDRS Biotech--
厌氧琼脂平板Hopebio--
活死细菌活力试剂盒Thermo Scientific--
高脂饮食Research DietsSYHF60-1
链脲佐菌素----
血糖仪Yuwell--
水合氯醛----
EDTAGreagent--
自动脱水机Thermo Scientific--
石蜡Leica--
Masson染色试剂盒Keygen Biotech--
显微CT扫描仪Scanco MedicalmCT 50

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
材料合成
CuHP合成:CuSO4 0.768g溶于10mL超纯水,加入500mL 0.02M PBS,反应6小时,离心10000rpm 5min,洗涤三次。SA/CuHP水凝胶:SA 1.5% w/v,CuHP浓度0.25%, 0.5%, 1%, 2%,CaCl2 1%交联。
阅读提示:Methods 2.2
细胞培养
BMSCs来自4周龄雌性SD大鼠,培养于αMEM(含10%FBS,1%PS),37°C,使用P3-P5代。
阅读提示:Methods 2.5
体外抗氧化实验
氧化应激模型:H-DMEM(25mM葡萄糖)+ 500μM H2O2处理3小时;对照和分组:Control, H2O2, H2O2+SA, H2O2+SA/CuHP, H2O2+SA/CuCl2。
阅读提示:Methods 2.7, Figure 3 legend
体外成骨分化实验
成骨诱导培养基:含10%FBS,1%PS,50μg/mL L-抗坏血酸,100nM地塞米松,10mM β-甘油磷酸;检测ALP Day7, ARS Day21, RUNX2 IF Day4, qRT-PCR Day4, WB Day7。
阅读提示:Methods 2.8-2.12, Figure 4 legend
体外抗菌实验
细菌:A.a ATCC 33384,浓度10^6 CFU/mL;处理:pH=5,37°C,24h;分组Control, H2O2, SA, H2O2+SA, SA/CuHP, H2O2+SA/CuHP;H2O2浓度500μM;平板计数、活死染色、SEM。
阅读提示:Methods 2.14, Figure 6 legend
体内动物实验
DP模型:4周龄雄性SD大鼠,高脂饮食4周,STZ 35mg/kg腹腔注射,血糖>16.7mmol/L;丝线结扎M2 3周;治疗:PBS/SA/SA/CuHP 10μL注射,每周两次;评估:抗菌2周,micro-CT 4周;样本量n=6/组。
阅读提示:Methods 2.15-2.17, Figure 7 legend