体外自组装颗粒表征与细胞摄取
评估Diprovocim与抗原自组装形成颗粒的能力及其对APC摄取的影响。
混合Diprovocim和OVA，检测颗粒直径和zeta电位，使用SEM观察形态，并用JAWSII和RAW264.7细胞进行摄取实验。
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自组装TLR2激动剂在小鼠中促进黏膜免疫反应而不引起肺部免疫病理损伤
Self-assembling TLR2 agonists promote mucosal immune responses without pulmonary immunopathologic injuries in mice.
实验完整度
高包含体外细胞模型（JAWSII、RAW264.7、BMDCs）和体内小鼠模型（C57BL/6），并进行了功能验证（吞噬、激活）和机制验证（TLR2通路、细胞因子）。
主要模型
JAWSII和RAW264.7细胞系 骨髓来源树突状细胞（BMDCs） C57BL/6小鼠模型 SARS-CoV-2假病毒中和实验
重点核对
Diprovocim与OVA或RBD-Fc以1:1比例混合形成约1μm颗粒 鼻内免疫剂量：OVA或RBD-Fc 30μg，Diprovocim 30μg，Pam2CSK4 10μg 免疫方案：三次免疫，间隔两周 抗体滴度检测：血清和BALF中IgG和IgA 假病毒中和实验：WT、Delta、BA.1、BA.5株
摘要
鼻腔疫苗在诱导黏膜免疫方面具有优势，特别是通过诱导二聚体IgA。然而，复杂的黏膜环境在实现最佳免疫原性和安全性方面构成挑战。本研究引入Diprovocim，一种TLR2激动剂，作为黏膜疫苗的有效且安全的佐剂。我们的结果表明，Diprovocim自组装成适合黏膜递送尺寸的颗粒，增强了淋巴结和肺部免疫细胞的抗原吞噬作用。在有效激活TLR2信号通路后，Diprovocim在体内导致炎症细胞因子释放减少，且无组织损伤或体重减轻，凸显了其安全性。在小鼠中，肌肉和鼻内免疫Diprovocim佐剂疫苗均诱导高滴度的全身抗体。在支气管肺泡灌洗液（BALF）中检测到更高的IgG和IgA抗体。此外，Diprovocim增强了卵清蛋白（OVA）和重组SARS-CoV-2蛋白（RFD-Fc）疫苗的免疫原性，实现了更高的CD4+和CD8+ T细胞免疫反应以及对SARS-CoV-2变异株的交叉保护。这些发现强调了自组装Diprovocim作为黏膜疫苗安全有效佐剂的潜力，为对抗呼吸道感染提供了一种有前景的策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 探讨TLR2激动剂Diprovocim作为黏膜疫苗佐剂的免疫原性和安全性。
- 核心机制
- Diprovocim通过TLR2信号通路激活NF-κB和MAPK通路，促进树突状细胞和巨噬细胞的吞噬和成熟，增强抗原呈递，从而诱导强效体液和细胞免疫应答。
- 主要证据
- 体外实验显示Diprovocim增强DC和巨噬细胞对OVA-Cy5的摄取，并上调CD40/CD86；体内实验显示Diprovocim增强MLN和肺中DC的吞噬和成熟，且诱导较少的炎症因子；免疫小鼠后诱导高滴度IgG和IgA，以及CD4+/CD8+ T细胞反应。
- 研究意义
- Diprovocim作为安全有效的鼻用佐剂，可增强亚单位疫苗的免疫原性，为呼吸道感染疫苗的开发提供新策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体内抗原摄取和DC激活
评估鼻内给药后Diprovocim对抗原在MLN和肺中的吞噬及DC成熟的影响。
小鼠鼻内给予OVA-Cy5与佐剂，24小时后分析MLN和肺中DC亚群的Cy5摄取和CD86/CD40表达。
炎症反应和安全性评估
比较Diprovocim与Pam2CSK4在鼻内免疫后引起的炎症反应和组织损伤。
监测小鼠体重变化，检测肺组织中Il6、Il1b和Tnf的mRNA表达，并进行组织病理学分析。
OVA免疫原性评价
评估Diprovocim作为佐剂经鼻内和肌肉免疫诱导的体液和细胞免疫应答。
C57BL/6小鼠分别经鼻内或肌肉免疫OVA加佐剂，三次免疫间隔两周，检测血清和BALF中特异性IgG/IgA，以及外周血中T细胞反应。
RBD-Fc疫苗免疫原性评价
评估Diprovocim作为佐剂对SARS-CoV-2 RBD-Fc亚单位疫苗免疫原性的增强作用。
小鼠鼻内免疫RBD-Fc加Diprovocim，三次免疫，检测血清和BALF中抗RBD IgG/IgA，假病毒中和实验，以及T细胞反应。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Corning | 10-040-CVRC |
| 青霉素-链霉素 | HyClone | SV30010 | |
| 胎牛血清 | ExCellBio | FSP500 | |
| BMDCs培养 | 小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 | BioLegend | 576306 |
| 流式分析 | FITC标记抗CD11c抗体 | BioLegend | 117305 |
| Pacific Blue标记抗CD86抗体 | BioLegend | 105021 | |
| PE标记抗CD40抗体 | BioLegend | 157505 | |
| 流式细胞仪 | BD | FACS | |
| RT-qPCR | RNA提取试剂盒 | Axygen | AP-MN-MS-RNA-250 |
| 逆转录试剂盒 | Thermo Fisher | K1691 | |
| TB Green Premix Ex Taq II | TaKaRa | RR820Q | |
| QuantStudio实时荧光定量PCR检测系统 | Thermo Fisher | -- | |
| 免疫荧光 | DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 |
| ProLong Gold防淬灭封片剂 | Thermo Fisher | P10144 | |
| 共聚焦荧光显微镜 | Olympus | FV-3000 | |
| 动物实验 | 异氟烷 | RWD | R510 |
| 组织处理 | ACK裂解缓冲液 | Biosharp | BL503A |
| 胶原酶D | Roche | -- | |
| 脱氧核糖核酸酶I | Roche | -- | |
| 流式分析 | PE标记抗CD11b抗体 | BioLegend | 101207 |
| BV421标记抗CD24抗体 | BioLegend | 101825 | |
| APC标记抗CD24抗体 | BioLegend | 138505 | |
| BV421标记抗CD86抗体 | BioLegend | 105032 | |
| APC标记抗CD40抗体 | BioLegend | 124611 | |
| 细胞刺激 | OVA323-339肽 | Syneptide Co., Ltd | -- |
| OVA257-264肽 | Syneptide Co., Ltd | -- | |
| SARS-CoV-2刺突蛋白肽库 | Sinobiological | PP003 | |
| 抗CD28抗体 | BioLegend | 102102 | |
| 布雷菲德菌素A | BioLegend | 420601 | |
| 佛波醇酯 | MultiSciences | 70-CD0001 | |
| 离子霉素 | MultiSciences | 70-CD0002 | |
| 流式分析 | Zombie Aqua™可固定活力染料试剂盒 | BioLegend | 423101 |
| 抗CD16/CD32抗体 | BioLegend | 101302 | |
| FITC标记抗CD3抗体 | BioLegend | 100203 | |
| PE标记抗CD4抗体 | BioLegend | 100407 | |
| BV711标记抗CD8a抗体 | BioLegend | 100747 | |
| 固定/透化液 | BD | 554714 | |
| 透化/洗涤缓冲液 | BD | 554723 | |
| BV421标记抗IFN-γ抗体 | BioLegend | 505829 | |
| APC标记抗TNF-α抗体 | BioLegend | 506307 | |
| ELISA | 辣根过氧化物酶标记抗小鼠IgG抗体 | Cell signaling Technology | 7076 |
| 辣根过氧化物酶标记抗小鼠IgA抗体 | SouthernBiotech | 1040-05 | |
| Varioskan Lux酶标仪 | Thermo Fisher | -- | |
| 假病毒中和实验 | 聚凝胺 | Beyotime | C0351 |
| 萤火虫荧光素酶裂解缓冲液 | Beyotime | RG126M | |
| 荧光素酶底物 | Beyotime | RG058M | |
| 生物层干涉 | 生物素 | Elabscience | E-LK-B002 |
| Octet® R8 | Sartorius | -- | |
| Octet® SA生物传感器 | Sartorius | -- | |
| 重组蛋白表达 | pFUSE-RBD-hIgG1-Fc2质粒 | -- | -- |
| 蛋白A+G琼脂糖 | Beyotime | P2019 | |
| 抗原 | 卵清蛋白 | Sigma-Aldrich | A5503 |
| 佐剂 | Diprovocim | -- | -- |
| Pam2CSK4 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体外自组装颗粒制备 | Diprovocim与OVA或RBD-Fc的混合比例（1:1）及颗粒直径（约1μm） 阅读提示：Results部分和图2a、6b |
| 体内抗原摄取实验 | 鼻内给药剂量（OVA-Cy5 30μg、Diprovocim 30μg、Pam2CSK4 10μg），检测时间点（24小时） 阅读提示：Methods中的Phagocytosis experiment in vivo部分 |
| 炎症反应评估 | 肺组织细胞因子mRNA表达检测时间点（8小时、1天、3天），组织病理学分析时间点（1天、3天） 阅读提示：Methods中的Histopathology部分及图4 |
| 免疫方案 | 免疫途径（鼻内/肌肉）、剂量（OVA或RBD-Fc 30μg、Diprovocim 30μg）、免疫次数和间隔（三次，间隔两周） 阅读提示：Methods中的Mice immunization and flow cytometry部分 |
| 抗体检测 | 血清和BALF采集时间（免疫后7天或14天），ELISA操作细节（包被浓度、稀释倍数） 阅读提示：Methods中的ELISA部分 |
| 假病毒中和实验 | 假病毒株（WT、Delta、BA.1、BA.5），血清稀释方法，中和抗体滴度计算方法 阅读提示：Methods中的Pseudovirus neutralization assay部分 |
| T细胞反应检测 | PBMC刺激条件（肽浓度、刺激时间、布雷菲德菌素A添加时间），抗体染色方案 阅读提示：Methods中的Mice immunization and flow cytometry部分 |