建立和表征顺铂耐药细胞系
建立顺铂耐药 HNSCC 亚系并验证其耐药表型
通过将 OC2 细胞长期暴露于递增浓度的顺铂（最终 1μM）持续 6 个月，获得耐药细胞亚系 OC2-CR1。通过 WST-1 实验测定 IC50 值，并通过 Western blot 检测 γH2AX 和 cleaved PARP 水平验证耐药性。
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ONC201 通过 ATF3/ATF4/CHOP 增强顺铂在头颈鳞状细胞癌细胞中的细胞毒性作用
ONC201 enhances the cytotoxic effect of cisplatin through ATF3/ATF4/CHOP in head and neck squamous cell carcinoma cells.
实验完整度
高包含体外细胞实验、耐药细胞模型、异种移植瘤模型、临床样本分析等多个独立证据层级，并有分子机制验证和体内外功能验证。
主要模型
OC2 头颈鳞状细胞癌细胞系 OC2-CR1 顺铂耐药细胞亚系 OC2 和 OC2-CR1 异种移植瘤模型 口腔鳞状细胞癌患者队列
重点核对
OC2-CR1 耐药细胞系的建立条件：长期递增浓度顺铂暴露，最终持续暴露于 1 μM 顺铂，持续 6 个月 药物处理浓度：ONC201（Selleckchem）和顺铂（Sigma-Aldrich）的具体使用浓度 动物实验给药方案：顺铂 3 mg/kg、ONC201 50 mg/kg，腹腔注射，每周两次，持续 4 周 体内实验：OC2 和 OC2-CR1 细胞皮下接种于裸鼠，每组 n≥6 临床队列：2011-2016 年间台湾高雄长庚纪念医院 45 例手术及顺铂辅助放化疗的 OSCC 患者
摘要
头颈鳞状细胞癌（HNSCC）由于其遗传异质性，仍然是普遍且难以治疗的癌症。顺铂耐药是局部晚期 HNSCC 治疗失败的重要原因之一。ONC201 是一种选择性多巴胺受体 D2 拮抗剂和线粒体 ClpP 激动剂，已成为多种恶性肿瘤的潜在抗肿瘤药物。本研究探讨了 ONC201 单独及与顺铂联合在顺铂敏感和耐药 HNSCC 细胞中的治疗潜力，重点关注内质网（ER）应激介导的细胞凋亡。通过长期药物暴露建立了顺铂耐药的 HNSCC 亚系（OC2-CR1）。评估了 ONC201 单独及与顺铂联合治疗对细胞活力、DNA 损伤、活性氧（ROS）产生和应激反应标志物的治疗效果。ONC201 在顺铂敏感和耐药的 HNSCC 细胞中均表现出强效细胞毒性，在 OC2-CR1 细胞中保持疗效。ONC201 与顺铂联合治疗显示出协同抑制增殖和迁移，并增强细胞凋亡诱导。机制上，ONC201 在顺铂敏感细胞中通过 ATF4/CHOP 信号诱导 ER 应激介导的细胞死亡，而在耐药细胞中 ATF3/CHOP 占主导。在体内，联合治疗显著抑制了异种移植模型中的肿瘤生长，包括顺铂耐药肿瘤，且未诱导毒性。免疫组织化学分析证实了肿瘤组织中 CHOP 的激活。此外，临床相关性显示，OSCC 患者中 CHOP 低表达与复发风险增加和无复发生存率降低显著相关。本研究提供了有力证据，表明 ONC201 通过 HNSCC 中不同的应激介导凋亡途径增强顺铂疗效。ONC201 克服顺铂耐药的能力及其协同抗肿瘤作用凸显了其作为联合治疗候选药物的前景。这些发现支持靶向 ATF3/ATF4/CHOP 轴以改善顺铂耐药 HNSCC 患者预后的转化潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- ONC201 单独或与顺铂联合能否通过 ER 应激介导的凋亡途径增强对顺铂敏感和耐药的头颈鳞状细胞癌细胞的抗肿瘤作用，并克服顺铂耐药性？
- 核心机制
- 在顺铂敏感细胞中，ONC201 通过 ATF4/CHOP 通路诱导 ER 应激介导的凋亡；在顺铂耐药细胞中，ONC201 和顺铂主要通过 ATF3/CHOP 通路诱导凋亡，最终均导致 MCL1 下调。
- 主要证据
- 体外细胞实验显示 ONC201 与顺铂联合协同抑制细胞活力和迁移并诱导凋亡；体内异种移植模型显示联合治疗显著抑制肿瘤生长，且 IHC 证实肿瘤组织中 CHOP 激活；临床样本分析显示 CHOP 低表达与 OSCC 患者复发风险增加和较差的无复发生存显著相关。
- 研究意义
- 该研究支持靶向 ATF3/ATF4/CHOP 轴作为治疗顺铂耐药 HNSCC 的转化潜力，表明 ONC201 与顺铂联合作为候选联合治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测 ROS 产生
观察 ONC201 和顺铂单独或联合对线粒体和细胞内 ROS 水平的影响
用 ONC201、顺铂或联合处理 OC2 和 OC2-CR1 细胞 24、48、72 小时，使用 MitoSOX Red 和 DHE 探针通过流式细胞术和共聚焦显微镜检测 ROS 水平。
Western blot 检测 ER 应激相关蛋白
分析 ONC201、顺铂及联合处理后 ER 应激标志物 ATF3、ATF4、CHOP 和凋亡相关蛋白的表达变化
用 ONC201、顺铂或联合处理 OC2 和 OC2-CR1 细胞，在不同时间点收集蛋白，通过 Western blot 检测 ATF3、ATF4、CHOP、γH2AX、cleaved PARP 和 MCL1 表达。
评估细胞活力、克隆形成、迁移和凋亡
评估 ONC201 和顺铂单独或联合对 HNSCC 细胞增殖、克隆形成、迁移和凋亡的影响
使用细胞计数、克隆形成实验、Oris 细胞迁移实验和 Annexin V/PI 染色流式细胞术评估药物处理后的细胞反应。
体内异种移植模型评估抗肿瘤效果
评估 ONC201 和顺铂单独或联合对体内肿瘤生长的抑制效果
将 OC2 或 OC2-CR1 细胞皮下植入裸鼠，14 天后随机分组，给予顺铂（3 mg/kg）、ONC201（50 mg/kg）或联合治疗，每周两次，持续 4 周，测量肿瘤体积和体重，并进行 H&E 及 IHC 分析。
临床样本分析
验证 CHOP 表达与 OSCC 患者预后的相关性
回顾性分析 45 例接受手术及辅助顺铂放化疗的 OSCC 患者的肿瘤组织样本，通过免疫组化评估 ATF3、ATF4、CHOP 表达，并分析其与复发及无复发生存的关系。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640 培养基 | Invitrogen | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素 | -- | -- | |
| 链霉素 | -- | -- | |
| 两性霉素 B 溶液 | Invitrogen | -- | |
| 药物处理 | 顺铂 | Sigma-Aldrich | -- |
| ONC201 | Selleckchem | -- | |
| 细胞活力检测 | WST-1 试剂 | Roche Diagnostics | -- |
| ROS 检测 | MitoSOX Red | Invitrogen | -- |
| 二氢乙锭 | Merck/Sigma-Aldrich | -- | |
| 免疫荧光 | DAPI | Molecular Probes | -- |
| 荧光封片剂 | Dako Cytomation | -- | |
| Western blot | PRO-PREP 蛋白提取液 | iNtRON Bio | -- |
| Bio-Rad 蛋白定量试剂盒 | Bio-Rad | -- | |
| ATF3 抗体 | Cell Signaling Technology | #33593 | |
| γ-H2AX 抗体 | Abcam | ab11174 | |
| ATF4 抗体 | Cell Signaling Technology | #11815 | |
| CHOP 抗体 | Cell Signaling Technology | #2895 | |
| c-PARP 抗体 | Cell Signaling Technology | #9541 | |
| MCL1 抗体 | Cell Signaling Technology | #5453 | |
| β-actin 抗体 | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| 化学发光底物 | Santa Cruz Biotechnology | -- | |
| RT-qPCR | NucleoSpin RNA II 试剂盒 | Macherey-Nagel | -- |
| High-Capacity cDNA 逆转录试剂盒 | Applied Biosystems | -- | |
| SYBR Green PCR 预混液 | Applied Biosystems | -- | |
| 7500 Fast 实时荧光定量 PCR 系统 | Applied Biosystems | -- | |
| 细胞计数 | 台盼蓝溶液 | Invitrogen | -- |
| Countess 3 FL 自动细胞计数器 | Invitrogen | -- | |
| 迁移实验 | Oris 细胞迁移组装试剂盒 | Platypus Technologies | -- |
| 四甲基罗丹明乙酯 | Invitrogen | -- | |
| 凋亡检测 | Annexin V 凋亡检测试剂盒 | BioLegend | -- |
| 流式分析 | BD LSRII 流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| 动物实验 | 唑拉西泮 | -- | -- |
| 免疫组化 | Mouse/Rabbit PolyDetector Plus DAB HRP 试剂盒 | BioSB | BSB0261 |
| ATF3 抗体 | Abcam | ab191513 | |
| ATF4 抗体 | Elabscience | E-AB-13942 | |
| CHOP 抗体 | Abcam | ab11419 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与耐药细胞建立 | 耐药诱导时顺铂的浓度梯度、处理周期为 6 个月、最终持续暴露于 1 μM 顺铂；培养基含 10% FBS、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素、250 μg/mL 两性霉素 B 阅读提示：Materials and methods: Induction of cisplatin resistance in OC2 cells and cell culture |
| 药物处理 | ONC201 和顺铂的浓度、处理时间（24、48、72 h） 阅读提示：Results 和 figure legends 中详细描述了药物浓度和处理时间 |
| 体内实验 | 小鼠品系（NU/NU 裸鼠）、小鼠周龄（6 周）、接种细胞数（1×10^7）、给药剂量（顺铂 3 mg/kg，ONC201 50 mg/kg）、给药频率（每周两次，持续 4 周）、开始给药时间（接种后 14 天） 阅读提示：Materials and methods: Animal care and xenograft model 和图 5 图注 |
| 临床样本分析 | 患者的纳入标准、样本量（45 例）、随访时间（中位 53.7 个月）、免疫组化评分标准（IRS） 阅读提示：Results: Validation the in vitro and xenograft results 和图 6 图注 |