筛选差异m6A修饰的circRNA
鉴定与心脏I/R相关的m6A修饰异常circRNA。
对I/R小鼠心脏和正常小鼠心脏进行m6A-circRNA表观转录组芯片分析，筛选差异表达的m6A修饰circRNA。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
环状RNA circDhx32通过结合FOXO1与AdipoR1竞争，促进小鼠心脏缺血再灌注损伤中的心脏炎症反应
Circular RNA circDhx32 promotes cardiac inflammatory responses in mouse cardiac ischemia-reperfusion injury via binding to FOXO1 competed with AdipoR1.
实验完整度
高包含体内I/R模型和体外H/R心肌细胞模型，并进行了功能验证（基因敲低）和机制验证（RIP、ChIP、荧光素酶报告基因等）。
主要模型
小鼠心脏I/R模型 新生小鼠心室心肌细胞H/R模型
重点核对
I/R模型：C57BL/6小鼠，LAD结扎45分钟再灌注24小时或2周 H/R模型：原代心肌细胞缺氧12小时复氧24小时 circDhx32敲低：AAV9-shRNA（3×10^11病毒颗粒）尾静脉注射，4周后手术 circDhx32 siRNA转染浓度：50 nM 检测：心功能（EF、FS），梗死面积（TTC），CK-MB和cTnT水平，炎症因子mRNA表达
摘要
缺血性心脏病是人类死亡的重要原因，对受损心肌的血液再供应可加剧心脏I/R损伤的风险。环状RNA（circRNAs）在心血管疾病中发挥重要作用。在本研究中，我们探讨了circDhx32在I/R损伤进展中的调控作用。通过结扎小鼠左前降支冠状动脉（LAD）45分钟，随后再灌注24小时或2周，建立心脏I/R模型。对于体外研究，新生小鼠心室心肌细胞接受缺氧复氧（H/R）攻击。CircDhx32在I/R处理的小鼠和H/R处理的心肌细胞中显著上调。心肌细胞特异性敲低circDhx32改善了心脏I/R损伤的病理结果，包括改善心功能、减少梗死面积和减少心脏损伤生物标志物的释放。circDhx32沉默的保护作用也在H/R后的心肌细胞中观察到。我们证明ALKBH5作为m6A去甲基化酶，去除circDhx32的m6A修饰位点。减少的m6A修饰抑制了m6A阅读器YTHDF2和YTHDC1的识别和结合，导致circDhx32在病理条件下降解和核质输出减少。升高的circDhx32通过结合FOXO1抑制AdipoR1的转录激活。相反，circDhx32缺失减轻了I/R处理小鼠和H/R处理心肌细胞的炎症反应，包括降低IL-6、TNF-α和IL-1β等炎症因子的mRNA表达水平和释放，可能通过调节AdipoR1-AMPK-NF-κB信号通路。总之，ALKBH5作为m6A擦除器，与m6A阅读器YTHDF2和YTHDC1一起，促进病理条件下circDhx32的高表达和核滞留。CircDhx32通过靶向AdipoR1-AMPK-NF-κB信号通路调控心脏I/R损伤的炎症反应，与AdipoR1竞争FOXO1。这些结果揭示了心脏缺血性损伤的新机制，circDhx32有望成为缺血性心脏病早期干预的潜在治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- circDhx32如何调控心脏缺血再灌注损伤中的炎症反应？
- 核心机制
- ALKBH5介导的m6A去甲基化减少circDhx32的m6A修饰，抑制YTHDF2和YTHDC1识别结合，增加其稳定性和核滞留；核内circDhx32与FOXO1结合，抑制FOXO1对AdipoR1的转录激活，下调AdipoR1表达，进而通过AdipoR1-AMPK-NF-κB通路促进炎症反应。
- 主要证据
- RNA pulldown、RIP、ChIP、荧光素酶报告基因、EMSA证明circDhx32与FOXO1结合并抑制AdipoR1转录；体内外功能实验显示circDhx32敲低改善心功能、减小梗死面积、减轻炎症。
- 研究意义
- circDhx32可能作为缺血性心脏病早期干预的潜在治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证circDhx32表达和特性
确认circDhx32在I/R和H/R条件下的表达变化及其环状结构。
通过qRT-PCR检测circDhx32表达；Sanger测序验证环化；放线菌素D和RNase R处理评估稳定性；细胞核质分离和FISH检测亚细胞定位。
功能丧失实验（体内和体外）
评估circDhx32沉默对I/R和H/R损伤的影响。
使用AAV9-shRNA在小鼠心肌细胞中敲低circDhx32，并建立I/R模型；体外培养心肌细胞转染si-circDhx32后建立H/R模型，检测心功能、梗死面积、心肌损伤标志物和细胞活力。
研究m6A修饰调控circDhx32稳定性
阐明ALKBH5介导的m6A去甲基化如何影响circDhx32的表达和定位。
检测ALKBH5表达，siRNA敲低ALKBH5后检测circDhx32稳定性；RIP检测circDhx32与YTHDF2和YTHDC1的结合；过表达或敲低YTHDF2/YTHDC1后观察circDhx32水平和定位。
验证circDhx32与FOXO1相互作用并调控AdipoR1转录
确定circDhx32是否通过结合FOXO1抑制AdipoR1转录。
RIP验证circDhx32与FOXO1结合；ChIP、荧光素酶报告基因和EMSA检测FOXO1与AdipoR1启动子结合及circDhx32的影响；qRT-PCR和Western blot检测AdipoR1表达变化。
评估circDhx32对炎症通路的影响
验证circDhx32通过AdipoR1-AMPK-NF-κB通路调节炎症反应。
在I/R小鼠和H/R心肌细胞中敲低circDhx32，检测AdipoR1表达、p-AMPK/AMPK和p-p65/p65比值以及IL-6、TNF-α、IL-1β的mRNA表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证免疫效应
评估体内效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | C57BL/6小鼠 | Changsheng Bio-technology Co., Ltd. | -- |
| 基因递送 | AAV9病毒 | -- | -- |
| 心功能检测 | Vevo2100超声心动图系统 | Visualsonics | -- |
| 梗死面积评估 | 伊文思蓝 | Solarbio | -- |
| TTC染色液 | Solarbio | -- | |
| 组织学染色 | H&E染色 | Solarbio | -- |
| 马松三色染色试剂盒 | Solarbio | -- | |
| 心肌损伤标志物检测 | LDH检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | -- |
| CK-MB ELISA试剂盒 | Elabscience | -- | |
| cTnT ELISA试剂盒 | Elabscience | -- | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Biological Industries | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 胰蛋白酶 | Solarbio | -- | |
| II型胶原酶 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 转染 | Lipofectamine 3000试剂 | Invitrogen | -- |
| X-treme gene siRNA转染试剂 | Roche | -- | |
| 细胞活力检测 | CCK-8溶液 | Beijing Labgic Technology Co., Ltd. | -- |
| 活/死细胞检测试剂盒 | Life Technologies | #L3224 | |
| FISH | FISH试剂盒 | RiboBio | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime Institute of Biotechnology | -- |
| 核质分离提取试剂盒 | Thermo Scientific Pierce | 78835 | |
| BCA蛋白浓度测定试剂盒 | Beyotime Institute of Biotechnology | -- | |
| 硝酸纤维素膜 | Millipore | -- | |
| GAPDH抗体 | ZsBio | #TA-08 | |
| Lamin B1抗体 | ABclonal | A11495 | |
| YTHDF2抗体 | Proteintech | 24744-1-AP | |
| YTHDC1抗体 | Proteintech | 14392-1-AP | |
| ALKBH5抗体 | Proteintech | 67811-1-AP | |
| FOXO1抗体 | Proteintech | 18592-1-AP | |
| 脂联素受体抗体 | Proteintech | 14361-1-AP | |
| p65抗体 | Proteintech | 10745-1-AP | |
| p-p65抗体 | Abcam | ab76302 | |
| AMPKα抗体 (D5A2) | Cell Signaling Technology | 5831S | |
| p-AMPKα (Thr172)抗体 | Cell Signaling Technology | 2535S | |
| Odyssey红外成像系统 | LI-COR | -- | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| 细胞质和细胞核RNA纯化试剂盒 | Norgen Biotek | -- | |
| RNA定量 | NanoDrop ND-8000分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| RT-qPCR | 逆转录试剂盒 | Toyobo | -- |
| SYBR Green预混液 | Toyobo | -- | |
| ABI 7900HT快速实时PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| circRNA稳定性验证 | RNase R | Epicenter | -- |
| m6A芯片 | m6A兔多克隆抗体 | Synaptic Systems | -- |
| RNeasy MinElute纯化试剂盒 | Qiagen | #74204 | |
| Super RNA标记试剂盒 | Arraystar | -- | |
| Arraystar circRNA表观转录组芯片 | Arraystar | 8×15 K | |
| Agilent扫描仪G2505C | Agilent | -- | |
| RIP | Magna RIP RNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒 | Millipore | -- |
| 蛋白A/G琼脂糖珠 | Roche | -- | |
| m6A抗体 | Synaptic Systems | #202003 | |
| 荧光素酶报告基因 | 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | -- |
| ChIP | SimpleChIP® Plus超声染色质IP试剂盒 | Cell Signaling Technology | -- |
| EMSA | NE-PER核质提取试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| LightShift化学发光EMSA试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 统计分析 | GraphPad Prism 9.0 | GraphPad Software | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物I/R模型 | 小鼠品系、周龄、体重、LAD结扎时间45分钟、再灌注时间24小时或2周、麻醉方式 阅读提示：Materials and methods: Mouse model of cardiac I/R injury |
| AAV9介导的基因敲低 | AAV9病毒剂量（3×10^11病毒颗粒）、注射途径（尾静脉）、手术时间（注射后4周） 阅读提示：Materials and methods: Gene delivery in mice |
| 原代心肌细胞培养和H/R模型 | 小鼠日龄（1-3天）、消化酶（胰蛋白酶、胶原酶II）、培养基（DMEM+10%FBS+双抗）、缺氧12小时复氧24小时 阅读提示：Materials and methods: Primary cardiomyocyte culture, Plasmid construction, siRNA interference and transfection |
| circDhx32功能实验 | si-circDhx32序列（见表S1）、转染浓度50 nM、转染试剂（X-treme gene）、检测指标（CCK-8、LDH、活死染色） 阅读提示：Materials and methods: Plasmid construction, siRNA interference and transfection; Results: Decreased circDhx32 relieves cardiomyocyte injury after H/R |
| m6A修饰调控 | Act D浓度5 μg/mL、si-ALKBH5、si-YTHDF2、si-YTHDC1的使用 阅读提示：Materials and methods: Actinomycin D (Act D) and RNase R treatment, RNA-binding protein immunoprecipitation (RIP) assay; Results: Reduced m6A modification of circDhx32 increases its stability and nuclear retention |
| 转录调控机制 | circDhx32过表达质粒剂量5 μg、FOXO1结合位点（-613至-623 bp）、ChIP和荧光素酶实验条件 阅读提示：Materials and methods: Luciferase reporter assay, Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay, Electrophoretic mobility shift assay (EMSA); Results: CircDhx32 interacts with FOXO1 and inhibits its transcriptional activation of AdipoR1 |
| 炎症通路检测 | 检测p-AMPK/AMPK、p-p65/p65比值、IL-6、TNF-α、IL-1β mRNA表达 阅读提示：Materials and methods: Western blotting, RNA isolation and qRT-PCR; Results: CircDhx32 regulates the inflammatory response via the AdipoR1-AMPK-NF-κB signaling pathway |