circRNA表达谱分析
鉴定胃癌组织和血浆中差异表达的circRNA
分析GEO数据集GSE194384、GSE93541和GSE83521，交叉比较筛选在组织和血浆中均上调的circTFRC，并在42对胃癌组织及40例患者血浆中验证。
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环状RNA TFRC/SCD1 mRNA相互作用调节胃癌中的铁死亡和转移
Circular RNA TFRC/SCD1 mRNA interaction regulates ferroptosis and metastasis in gastric cancer.
实验完整度
高包含体外细胞实验、机制验证（RIP、RNA pull-down、放线菌素D处理）以及体内异种移植和转移模型，多个独立证据层级且含功能验证。
主要模型
胃癌细胞系AGS、HGC-27、MKN-45、MKN-28 正常胃上皮细胞系GES-1 NOD-SCID小鼠皮下异种移植模型 NOD-SCID小鼠尾静脉转移模型
重点核对
circTFRC敲低效率：两个siRNA（si-circTFRC#1, si-circTFRC#2）靶向BSJ位点，qRT-PCR验证。 铁死亡诱导条件：RSL3（1 μM）和Fer-1（0.75 μM）处理16小时。 动物模型：皮下接种5×10^6细胞，瘤内注射circTFRC siRNA（5 nmol/次）每3天一次，共21天；转移模型尾静脉注射3×10^6细胞，静脉注射siRNA（10 nmol/次）每3天一次。 Western blot抗体：ELAVL1（Proteintech, #11910-1-AP; 1:2000）、SCD1（Proteintech, #28678-1-AP; 1:2000）、GPX4（ABclonal, A11243; 1:1000）、β-actin（CST, 3700S; 1:5000）。
摘要
铁死亡是一种铁依赖的程序性细胞死亡形式，有望用于癌症治疗。环状RNA在多种肿瘤类型中广泛表达，调节多种细胞生物学过程，包括铁死亡。然而，环状RNA在胃癌相关铁死亡中的调控动态仍知之甚少。在此，circTFRC（circBase ID: hsa_circ_0068606），一种新型环状RNA，被确定为在胃癌组织和细胞系中显著上调，其血浆水平与肿瘤大小和转移状态密切相关。靶向抑制circTFRC增强了铁死亡性细胞死亡，导致胃癌细胞体外增殖和运动能力降低。在分子水平上，circTFRC直接结合SCD1 mRNA，通过招募RNA结合蛋白ELAVL1稳定并增强其翻译。升高的SCD1表达减轻了铁死亡并促进了致癌性脂质代谢重编程，从而驱动胃癌进展。体内研究进一步证实，circTFRC沉默促进了铁死亡并抑制了肿瘤生长和进展。这些结果描绘了一个circTFRC介导的轴，该轴损害胃癌细胞的铁死亡脆弱性并支持恶性肿瘤进展。circTFRC可作为具有诊断潜力的生物标志物和靶向胃癌铁死亡治疗的候选靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 环状RNA如何调控胃癌中的铁死亡及其在肿瘤进展中的作用？
- 核心机制
- circTFRC通过直接结合SCD1 mRNA并招募ELAVL1，增强SCD1 mRNA的稳定性和翻译，导致SCD1表达上调，从而抑制铁死亡并促进胃癌进展。
- 主要证据
- 体外实验中，circTFRC敲低促进铁死亡（增加细胞死亡、脂质ROS和MDA），并抑制增殖和迁移；机制上，RNA pull-down和RIP实验证明circTFRC与ELAVL1和SCD1 mRNA相互作用；体内实验中，circTFRC siRNA抑制肿瘤生长和肺转移，并伴随SCD1下调。
- 研究意义
- 该研究首次阐明circTFRC/SCD1 mRNA相互作用在保护胃癌细胞免于铁死亡和促进肿瘤进展中的核心作用，为基于铁死亡的胃癌治疗策略提供了潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
circTFRC特征验证
确认circTFRC的环状结构和亚细胞定位
通过散聚引物PCR、Sanger测序、RNase R处理、放线菌素D处理、RNA FISH和核质分离实验验证circTFRC的环状特性和细胞质定位。
circTFRC功能缺失实验
评估circTFRC敲低对胃癌细胞增殖、迁移和铁死亡的影响
使用siRNA敲低circTFRC，通过CCK-8、克隆形成、Transwell、PI染色、脂质ROS检测、MDA检测等方法评估细胞功能。
机制探索：circTFRC与ELAVL1和SCD1 mRNA的相互作用
阐明circTFRC如何调节SCD1表达进而影响铁死亡
通过RNA pull-down、RIP、放线菌素D处理、Western blot等实验证明circTFRC直接结合SCD1 mRNA并招募ELAVL1稳定SCD1的机制。
功能恢复实验
验证SCD1是circTFRC促进胃癌进展的关键下游效应分子
在circTFRC敲低细胞中过表达SCD1，通过CCK-8、克隆形成、Transwell、PI染色、脂质ROS和MDA检测观察是否逆转敲低效应。
体内动物实验
评估circTFRC敲低对体内肿瘤生长和转移的影响
建立皮下异种移植和尾静脉转移模型，使用in vivo优化的siRNA处理，监测肿瘤体积、重量、肺转移结节，并通过qRT-PCR、IHC和MDA检测验证机制。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| RNA提取和qRT-PCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| RiverTra Ace qPCR RT预混液 | TOYOBO | -- | |
| KOD SYBR qPCR预混液试剂盒 | TOYOBO | -- | |
| LightCycler 480实时荧光定量PCR系统 | Roche | -- | |
| RNA稳定性检测 | 核糖核酸酶R | Epicenter Technologies | -- |
| 核质分离 | 胞质和核RNA纯化试剂盒 | Norgen Biotek | -- |
| RNA FISH | GenePharma RNA FISH试剂盒 | GenePharma | -- |
| Cy3标记的FISH探针 | GenePharma | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| 嘌呤霉素 | Gibco | -- | |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂 | Abbkine | -- |
| BioTek酶标仪（ELX800） | BioTek instruments | ELX800 | |
| 细胞迁移检测 | Transwell小室（8 μm孔径） | Corning | -- |
| 铁死亡检测 | RSL3 | -- | -- |
| Ferrostatin-1（Fer-1） | -- | -- | |
| 细胞死亡检测 | 碘化丙啶 | -- | -- |
| Cytek Northern Lights-CLC全光谱流式细胞仪 | Cytek Biosciences | -- | |
| FlowJo V10.8软件 | -- | -- | |
| 脂质ROS检测 | C11 BODIPY 581/591探针 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 共聚焦培养皿 | Biosharp | -- | |
| LEICA STELLARIS 5共聚焦显微镜平台 | Leica Microsystems | -- | |
| MDA检测 | MDA比色法检测试剂盒 | Elabscience | -- |
| 细胞内ROS检测 | CM-H2DCFDA荧光探针 | Glpbio | -- |
| 线粒体ROS检测 | MitoSOX Red线粒体探针 | Glpbio | -- |
| 细胞内Fe2+检测 | FerroOrange荧光探针 | DOJINDO | F374 |
| Western blotting | 细胞裂解液 | Cell Signaling Technology | -- |
| 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物 | Cell Signaling Technology | -- | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| PVDF膜（0.2 μm） | Millipore | -- | |
| 增强化学发光底物 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| ChemiDoc Touch成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| Image Lab软件 | Bio-Rad | -- | |
| ELAVL1抗体 | Proteintech | 11910-1-AP | |
| SCD1抗体 | Proteintech | 28678-1-AP | |
| GPX4抗体 | ABclonal | A11243 | |
| β-actin抗体 | Cell Signaling Technology | 3700S | |
| RIP | EZ-Magna RNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒 | Merck KGaA | -- |
| RNA pull-down | Pierce磁性RNA-蛋白质Pull-Down试剂盒 | Pierce Biotechnology | -- |
| 生物素标记探针 | Sangon Biotech | -- | |
| 动物实验 | NOD-SCID小鼠 | SLAC Laboratory Animal Co., Ltd | -- |
| circTFRC siRNA（体内优化） | RiboBio | -- | |
| D-荧光素 | YEASEN | 40902ES03 | |
| IVIS Spectrum小动物活体成像系统 | PerkinElmer | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床样本收集 | GC组织及配对邻近正常组织共42对，来自未接受新辅助治疗的胃癌患者；血浆样本来自40例GC患者和20例健康对照；正常胃黏膜样本来自3名健康个体。所有样本需经伦理批准（2023-S371）并获得知情同意。 阅读提示：Methods中的Patients and samples部分 |
| 细胞培养 | GES-1、AGS、HGC-27、MKN-45、MKN-28细胞株来自ATCC；培养基RPMI 1640（Gibco）+10% FBS（Sigma-Aldrich）+100 IU/ml青霉素+100 mg/ml链霉素；培养条件5% CO2，37°C；细胞身份经STR鉴定。 阅读提示：Methods中的Cell lines and cell culture部分 |
| circTFRC敲低 | siRNA靶向circTFRC BSJ区域，序列为si-circTFRC#1 GTCATGAGAGTTCTTCTGTGT-dTdT和si-circTFRC#2 GATCGTGTCATGAGAGTTCTT-dTdT；使用Lipofectamine 3000转染；稳定敲低使用shRNA慢病毒（GeneChem）和5-10 μg/mL嘌呤霉素筛选。 阅读提示：Methods中的siRNAs, plasmid, shRNAs, lentivirus construction, and cell transfection部分 |
| 铁死亡诱导和抑制 | RSL3（1 μM）和Fer-1（0.75 μM）处理16小时；对于组合实验，Fer-1浓度可能为0.25 μM（某些克隆形成实验）或0.75 μM（其他实验）。 阅读提示：Methods中的RSL3 and ferrostatin-1 treatment部分 |
| 体内实验 | 皮下移植5×10^6细胞；瘤内注射circTFRC siRNA（5 nmol/次）每3天一次，共21天；转移模型尾静脉注射3×10^6细胞，静脉注射circTFRC siRNA（10 nmol/次）每3天一次，6周；每组n=7。 阅读提示：Methods中的Animal experiments部分 |