筛选与ZMPSTE24相互作用并具有抗病毒功能的蛋白
鉴定新的宿主抗病毒因子
通过AP-MS分析稳定表达ZMPSTE24-FLAG的HEK293细胞中与ZMPSTE24相互作用的蛋白，选取候选蛋白进行RNAi筛选，用VSV-luci和VACV-luci感染检测相对荧光素酶活性。
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ATP2A2调节STING1/MITA驱动的信号转导，包括选择性自噬。
ATP2A2 regulates STING1/MITA-driven signal transduction including selective autophagy.
实验完整度
高包括体外细胞实验（HEK293、HeLa、THP-1等）、功能验证（病毒抑制、信号通路检测）、机制验证（相互作用、聚合、运输、自噬）以及基因敲除/敲低和回补实验，证据层级多样。
主要模型
HEK293细胞 HeLa细胞 THP-1细胞 MEF细胞
重点核对
ATP2A2与STING1的相互作用依赖于STING1的N端1-9氨基酸和ATP2A2的1-253及604-1042片段 ATP2A2敲除减弱STING1的聚合和从内质网到高尔基体的转运 SEC62介导的STING1选择性自噬依赖于ATP2A2 STING1激动剂diABZI浓度（1mM）和处理时间（1-2小时）
摘要
STING1/MITA不仅诱导先天免疫反应，还触发巨自噬/自噬以选择性降解信号分子。然而，调控STING1介导的选择性自噬的分子机制仍不清楚。在此，我们首次报道ATP2A2直接与STING1相互作用，通过调节其聚合和运输来调节STING1介导的先天免疫反应，从而抑制DNA病毒感染。值得注意的是，在筛选参与STING1介导的选择性自噬的网状自噬受体时，我们确定了SEC62是STING1介导的网状自噬中的重要受体蛋白。机制上，SEC62在激活时增强其与STING1的相互作用，同时在饥饿时促进STING1介导的网状自噬，这些过程依赖于ATP2A2。此外，在WT细胞中敲低SEC62抑制STING1介导的MAP1LC3B/LC3B脂化和自噬体形成，这种效应在ATP2A2敲除细胞中消失，表明SEC62在STING1介导的选择性自噬中的作用依赖于ATP2A2。因此，我们的发现确定了网状自噬受体SEC62作为调节STING1介导的选择性自噬的新型受体蛋白，为网状自噬受体在STING1诱导的选择性自噬过程中的机制提供了新的见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- ATP2A2如何调节STING1介导的先天免疫反应和选择性自噬？
- 核心机制
- ATP2A2与STING1直接相互作用，促进STING1的聚合和从内质网到高尔基体的转运，从而增强STING1介导的干扰素反应；此外，ATP2A2依赖网状自噬受体SEC62促进STING1介导的LC3脂化和网状自噬。
- 主要证据
- Co-IP和GST pull-down证明ATP2A2-STING1直接相互作用；ATP2A2敲除导致STING1聚合、TBK1磷酸化及IRF3二聚化减弱；SEC62敲低抑制STING1介导的LC3脂化和自噬体形成，但在ATP2A2敲除细胞中无进一步效应。
- 研究意义
- 揭示ATP2A2作为STING1的正向调节因子，在先天免疫和选择性自噬中发挥双重作用，为理解STING1介导的网状自噬机制提供新见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证ATP2A2的抗病毒功能及病毒种类特异性
确定ATP2A2抑制哪些病毒以及是否依赖其钙泵功能
过表达或敲低ATP2A2后感染多种病毒（HSV-1、VACV、牛痘病毒、VSV、SeV、流感病毒），通过荧光素酶报告基因、免疫印迹和空斑实验检测病毒复制。并检测ATP2A2突变体（F256A、E309A、D351A、D799A）的抗病毒能力。
确定ATP2A2与STING1的相互作用及其对STING1信号通路的影响
研究ATP2A2是否通过STING1调节先天免疫信号
通过co-IP检测ATP2A2与先天免疫通路蛋白（CGAS、STING1、TBK1、IRF3、RIGI、MAVS）的相互作用；在ATP2A2敲除细胞中检测STING1介导的IFNB启动子活性、TBK1和IRF3磷酸化。
研究ATP2A2对STING1聚合和转运的影响
阐明ATP2A2调节STING1活性的机制
在ATP2A2敲除细胞中检测STING1的聚合（SDD-AGE）和IRF3二聚化（Native PAGE），并通过免疫荧光观察STING1从内质网到高尔基体的转运（共定位CANX和GM130）。
研究ATP2A2对STING1介导的LC3脂化和自噬的影响
确定ATP2A2是否调节STING1介导的非经典自噬
在ATP2A2敲除细胞中检测STING1激动剂diABZI诱导的LC3B脂化，使用RFP-GFP-LC3B报告基因检测自噬流，并检测STING1与LC3B的共定位。
筛选并验证介导STING1选择性自噬的网状自噬受体
寻找STING1介导自噬所需的网状自噬受体
通过co-IP检测ATP2A2与网状自噬受体（NBR1、SEC62、RETREG1、RTN3L、CCPG1、TEX264）的相互作用，发现SEC62与STING1的相互作用依赖ATP2A2；通过敲低SEC62检测STING1介导的LC3脂化、自噬体形成和STING1降解。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证蛋白相互作用
评估病毒复制
评估基因功能
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Biosharp | BL304A |
| 胎牛血清 | Cellmax | SA201.02 | |
| 青霉素-链霉素 | Sigma-Aldrich | 516106 | |
| 谷氨酰胺补充剂 | Gibco | 35050061 | |
| RPMI-1640培养基 | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| 细胞转染 | 聚乙烯亚胺 | Sigma-Aldrich | 408727 |
| Lipofectamine 2000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| 刺激处理 | 小牛胸腺DNA | Invitrogen | D4522 |
| 环二鸟苷酸 | InvivoGen | 2222132-40-1 | |
| 聚肌胞苷酸 | InvivoGen | tlrl-piclv | |
| 干扰素刺激DNA | InvivoGen | tlrl-isdc | |
| 双链RNA | InvivoGen | tlrl-3prna | |
| diABZI | InvivoGen | tlrl-diabzi-2 | |
| 慢病毒感染 | 聚凝胺 | Sigma-Aldrich | H9268 |
| 药物筛选 | 嘌呤霉素 | Sigma-Aldrich | 400051 |
| 潮霉素 | Sigma-Aldrich | 540222 | |
| 细胞饥饿 | 厄尔平衡盐溶液 | Sigma-Aldrich | E2888 |
| 荧光素酶报告基因 | 双荧光素酶报告系统 | Promega | E1910 |
| 荧光素酶检测系统 | Promega | G7940 | |
| 病毒空斑实验 | 甲基纤维素 | Sigma-Aldrich | M0512 |
| 结晶紫 | Yeasen | 60505ES25 | |
| 甲醇 | Wuhan Xinshenshi | 800804SS | |
| 乙醇 | Shanghai Macklin | E821482 | |
| DNA提取 | 动物组织/细胞基因组DNA提取试剂盒 | Solarbio | D1700 |
| RNA提取 | RNA提取试剂 | Vazyme | R401-01 |
| ELISA | IFNB ELISA试剂盒 | Elabscience | E-el-H0085c |
| 逆转录PCR | 逆转录酶 | Vazyme | R212-01 |
| 实时定量PCR | SYBR Green RT-PCR试剂盒 | Vazyme | Q121-02 |
| 免疫印迹 | NP-40 | Sigma-Aldrich | I3021 |
| 甘油 | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| 不含EDTA的完全蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Trans-Blot Turbo转印系统 | Bio-Rad | -- | |
| 免疫共沉淀 | 抗FLAG M2磁珠 | Sigma-Aldrich | A2220 |
| 3×FLAG肽 | Sigma-Aldrich | F4799 | |
| 蛋白A/G PLUS-琼脂糖 | Thermo Fisher Scientific | 53133 | |
| Native PAGE | 钒酸钠 | Sigma-Aldrich | 450243 |
| 脱氧胆酸钠 | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| SDS-PAGE | 十二烷基硫酸钠 | Sigma-Aldrich | L3771 |
| Native PAGE | 溴酚蓝 | Yeasen | 60503ES25 |
| 甘氨酸 | Aladdin | C614005 | |
| SDD-AGE | TBE缓冲液 | Aladdin | T301543 |
| GST pull-down | 异丙基硫代半乳糖苷 | MBI | YZ-R0392 |
| GST结合树脂 | Novagen | D00135640 | |
| 免疫荧光 | Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | V900933 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | |
| Alexa Fluor 488二抗 | Invitrogen | A11034 | |
| Alexa Fluor 594二抗 | Invitrogen | A11032 | |
| Zeiss LSM880共聚焦激光显微镜 | Zeiss | -- | |
| Leica Stellaris 5 WLL共聚焦显微镜 | Leica | -- | |
| 抗体 | 抗ATP2A2抗体 | ABclonal | A1097 |
| 抗STING1抗体 | -- | -- | |
| 抗磷酸化STING1抗体 | Cell Signaling Technology | 509075 | |
| 抗磷酸化TBK1抗体 | Cell Signaling Technology | 54382 | |
| 抗TBK1抗体 | ABclonal | A3458 | |
| 抗磷酸化IRF3抗体 | Abcam | ab76493 | |
| 抗IRF3抗体 | Santa Cruz | sc-33642 | |
| 抗STAT1抗体 | ABclonal | A12075 | |
| 抗磷酸化STAT1抗体 | Cell Signaling Technology | 9171 | |
| 抗LC3B抗体 | Beyotime | AF5225 | |
| 抗钙联蛋白抗体 | Proteintech | 10427-2-AP | |
| 抗SEC62抗体 | Taizhou Baijia | IPB9041 | |
| 抗GAPDH抗体 | Wuhan Dia-an | 2058ZF | |
| 抗FLAG抗体 | Sigma-Aldrich | F3165 | |
| 抗HA抗体 | Wuhan Dia-an | 2063 | |
| 抗V5抗体 | Proteintech | 14440-1-AP | |
| 抗NP抗体 | BEI Resources | NR-4282 | |
| 抗ICP0抗体 | -- | -- | |
| 免疫荧光抗体 | 抗钙联蛋白抗体 | GeneTex | GTX109669 |
| 抗GOLGA2/GM130抗体 | Cell Signaling Technology | 12480 | |
| 抗HA抗体 | Cell Signaling Technology | 3724 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与刺激 | 细胞系（HEK293、HeLa、THP-1等）、刺激物（ctDNA、c-di-GMP、diABZI等）的浓度和处理时间 阅读提示：Materials and methods 中 'Cell culture and transfection' 和 'Stimulants and viruses' 部分，以及图注中相关刺激条件 |
| 基因敲除/敲低 | sgRNA/shRNA序列、转染方法、敲除效率验证 阅读提示：Materials and methods 中 'Establishing stable cell lines' 部分及表S2 |
| 蛋白质相互作用 | 抗体、免疫沉淀条件（裂解液、孵育时间、洗涤次数） 阅读提示：Materials and methods 中 'Immunoprecipitation' 部分及图注中抗体信息 |
| STING1聚合和转运检测 | SDD-AGE和Native PAGE的具体条件、刺激时间、细胞数量 阅读提示：Materials and methods 中 'Native PAGE and SDD-AGE' 部分及图5 |
| 自噬检测 | LC3B脂化检测条件、RFP-GFP-LC3B报告基因使用、自噬流定量方法 阅读提示：Materials and methods 中 'Cell starvation' 和 'Immunofluorescence' 部分，以及图6和7的图注 |