体外药效评估
评估CuB对OSCC细胞增殖、迁移和死亡的影响。
用不同浓度CuB处理HOK、HSC-3和SCC-9细胞，进行CCK-8、克隆形成、划痕实验、细胞形态观察和流式细胞术检测。
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葫芦素B通过GSDME诱导口腔鳞状细胞癌细胞焦亡并抑制肿瘤生长
Cucurbitacin B induces oral squamous cell carcinomapyroptosis via GSDME and inhibits tumour growth.
实验完整度
高包含体外细胞实验、体内4NQO诱导小鼠模型、生物信息学分析及分子机制验证，涵盖功能与机制验证。
主要模型
HSC-3人舌鳞癌细胞系 SCC-9人舌鳞癌细胞系 4NQO诱导的C57BL/6小鼠OSCC模型 人OSCC组织样本和正常口腔上皮组织
重点核对
CuB浓度依赖性抑制OSCC细胞活力，SCC-9和HSC-3的IC50分别为148.7 nM和84.78 nM（24小时） 4NQO小鼠模型：饮用水中加入50 μg/mL 4NQO，连续16周诱导OSCC CuB给药剂量：0.25 mg/kg或0.5 mg/kg腹腔注射，每日一次，持续28天 STAT3在OSCC中上调，通过TCGA数据库和IHC验证（n=10） STAT3过表达逆转CuB对STAT3、caspase-3、GSDME的抑制，并降低GSDME-N、IL-1β、IL-18水平
摘要
背景：焦亡是一种程序性细胞死亡形式，已被证明可诱导抗肿瘤免疫并抑制肿瘤生长。口腔鳞状细胞癌（OSCC）是一种常见的恶性肿瘤，诱导焦亡可能作为一种治疗策略使其受益。葫芦素B（CuB）是一种来源于多种植物的天然化合物，具有广泛的抗肿瘤活性。然而，CuB是否能通过焦亡在OSCC中发挥抗肿瘤作用尚不清楚。结果：CuB显著抑制OSCC细胞的增殖，诱导焦亡，并提高细胞上清液中炎症因子的水平。生物信息学分析预测了焦亡在OSCC中的潜在作用，随后在4NQO诱导的OSCC小鼠模型中得到了验证。结果表明，CuB不仅具有肿瘤抑制作用，还增加了肿瘤周围CD8+ T细胞的浸润。为了阐明CuB诱导焦亡的机制，STAT3被确定为CuB在OSCC中的关键靶点，其表达在肿瘤组织中上调。进一步实验表明，CuB通过抑制STAT3表达并促进caspase-3和Gasdermin-E（GSDME）的裂解来诱导焦亡。结论：CuB通过STAT3/caspase-3/GSDME通路触发OSCC焦亡，增强肿瘤周围CD8+ T细胞浸润，为提升肿瘤免疫治疗疗效提供了一种新策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CuB是否通过诱导焦亡抑制OSCC生长，并阐明其潜在机制及对肿瘤免疫微环境的影响。
- 核心机制
- CuB通过抑制STAT3表达，激活caspase-3，进而裂解GSDME形成GSDME-N，诱导OSCC细胞焦亡。
- 主要证据
- 体外显示CuB诱导细胞焦亡特征（细胞肿胀、膜破裂、GSDME-N表达升高），体内4NQO模型显示肿瘤抑制和CD8+ T细胞浸润增加；STAT3过表达和caspase-3抑制剂逆转CuB效应。
- 研究意义
- 为OSCC免疫治疗提供新策略，通过诱导焦亡增强抗肿瘤免疫，并可能改善免疫治疗疗效。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
焦亡表型鉴定
确认CuB诱导的细胞死亡类型为焦亡。
通过显微镜观察细胞形态、透射电镜观察膜孔形成、Annexin V/PI染色、phalloidin染色、ELISA检测IL-1β和IL-18释放。
生物信息学分析
预测焦亡在OSCC中的作用及相关靶点。
从TCGA获取OSCC转录组数据，筛选焦亡相关差异表达基因，进行GO/KEGG富集分析，并结合药物和疾病数据库预测CuB靶点。
分子机制验证
验证STAT3/caspase-3/GSDME通路在CuB诱导焦亡中的作用。
检测STAT3、caspase-3、GSDME的表达和裂解，通过STAT3过表达、caspase-3抑制剂和ROS抑制剂处理细胞。
体内疗效评估
评估CuB在体内对OSCC肿瘤生长的影响及免疫调节作用。
使用4NQO诱导的OSCC小鼠模型，给予CuB腹腔注射，测量肿瘤面积、体重变化，HE染色，流式检测CD3和CD8+ T细胞浸润。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| F12培养基 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素 | meilunbio | -- | |
| 链霉素 | meilunbio | -- | |
| 药物处理 | 葫芦素B | meilunbio | -- |
| 二甲基亚砜 | MCE | -- | |
| 细胞增殖检测 | CCK-8试剂盒 | Boster Bio | -- |
| 细胞死亡检测 | 凋亡和坏死检测试剂盒（Hoechst33342/PI） | Beyotime | -- |
| 活性氧检测 | 活性氧检测试剂盒 | Beyotime | -- |
| 凋亡检测 | Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒 | Beyotime | -- |
| 细胞染色 | 结晶紫染料 | Beyotime | -- |
| 细胞核染色 | DAPI染液 | Boster Bio | -- |
| 细胞骨架染色 | 鬼笔环肽 | Solarbio | -- |
| 免疫组织化学 | DAB显色试剂盒 | Boster Bio | -- |
| 抑制剂处理 | Ac-DEVD-CHO | MCE | -- |
| 乙酰半胱氨酸 | MCE | -- | |
| Western blot | 抗磷酸化STAT3抗体 | -- | -- |
| 抗STAT3抗体 | -- | -- | |
| 抗活化+前体caspase-3抗体 | HUABIO | -- | |
| GSDME抗体 | proteintech | -- | |
| 裂解型GSDME抗体 | ABclonal | -- | |
| GSDMD抗体 | ABclonal | -- | |
| RT-qPCR | Trizol试剂 | Mei5bio | -- |
| SYBR Green荧光染料 | Solarbio | -- | |
| 免疫荧光 | Alexa Fluor 488荧光二抗 | -- | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | -- | -- | |
| 蛋白质分离 | SDS-PAGE凝胶电泳 | -- | -- |
| 蛋白质转印 | 硝酸纤维素膜 | -- | -- |
| ELISA | IL-1β ELISA试剂盒 | Jiangsu Meimian Industrial | -- |
| IL-18 ELISA试剂盒 | Jiangsu Meimian Industrial | -- | |
| 基因过表达 | STAT3-pcDNA3.1(+)载体 | SinoBiological | -- |
| 基因转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | -- | -- |
| Opti-MEM培养基 | -- | -- | |
| 流式细胞术 | 细胞染色缓冲液 | Elabscience | -- |
| PE抗小鼠CD3抗体 | Elabscience | -- | |
| APC抗小鼠CD8抗体 | Elabscience | -- | |
| 组织染色 | 胰酶（含0.02% EDTA） | -- | -- |
| 伊红 | Abiowell | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与处理 | 细胞系来源：HOK (Sciencell)、HSC-3 (ATCC)、SCC-9 (ATCC)；培养基：DMEM或F12+10%FBS；CuB浓度和IC50（SCC-9 148.7 nM，HSC-3 84.78 nM，24小时） 阅读提示：Materials and Methods: Cell lines, reagents, and antibodies; Figure 1b |
| 细胞死亡检测 | Annexin V/PI染色、透射电镜、phalloidin染色、ROS检测的protocol细节 阅读提示：Materials and Methods: Cell death detection, Transmission electron microscopy, ROS; Figure 1f-i |
| 体外机制验证 | STAT3过表达质粒构建、转染条件（2.5 μg, 48 h）、caspase-3抑制剂浓度（Ac-DEVD-CHO 10 μM, 30 min）、ROS抑制剂（NAC 10 mM, 2 h） 阅读提示：Materials and Methods: Plasmid construction and transfection, Western blot; Figure 5i, 6, 7 |
| 体内动物模型 | 小鼠品系（C57BL/6，雌性，6-8周，18-22 g）、4NQO浓度（50 μg/mL饮用水）、诱导时间（16周）、CuB剂量（0.25或0.5 mg/kg，腹腔注射，每日，28天） 阅读提示：Materials and Methods: In vivo experiments; Figure 3 |
| 免疫浸润分析 | CD3和CD8+ T细胞检测方法（流式）、抗体（PE-CD3, APC-CD8） 阅读提示：Materials and Methods: CD3 and CD8+ T cell infiltration; Figure 3e-f |