建立肝转移模型并分析KCs极化
验证在CRC肝转移过程中肝脏KCs是否发生M2极化。
通过脾内注射CT26细胞建立肝转移小鼠模型，利用F4/80免疫组化、qRT-PCR和Western blot检测M1/M2标志物，免疫荧光观察肿瘤组织。
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高转移性肿瘤来源的CXCL16通过PI3K/AKT/FOXO3a通路诱导Kupffer细胞极化介导肝转移定植
High metastatic tumor-derived CXCL16 mediates liver colonization metastasis by inducing Kupffer cell polarization via the PI3K/AKT/FOXO3a pathway.
实验完整度
高包含体内小鼠模型、体外共培养、RNA-seq、敲低验证、通路抑制剂、双荧光素酶和ChIP等，且具有功能验证和机制验证。
主要模型
BALB/c小鼠脾内注射CT26细胞建立的结直肠癌肝转移模型 CT26和MC38小鼠结直肠癌细胞系 小鼠肝脏Kupffer细胞（ImKC） CT26-LM（肝转移倾向细胞系）
重点核对
小鼠品系：6周龄雌性BALB/c小鼠 细胞系：CT26和MC38结直肠癌细胞系、ImKC Kupffer细胞 CXCL16敲低：shRNA序列及转染条件 共培养体系：CT26与KCs采用0.4 µm孔径transwell共培养24小时，细胞比例为2:5 体内给药：ML339剂量10 mg/kg、LY294002剂量50 mg/kg，给药频率为每两天一次
摘要
肝转移是多种癌症的晚期表现，常与患者预后不良相关。Kupffer细胞（KCs）是肝脏驻留巨噬细胞，在肝转移（LM）中发挥关键作用。然而，KCs极化促进结直肠癌（CRC）肝转移的机制仍不清楚。在此，我们建立了CRC肝转移小鼠模型，并采用共培养系统，发现KCs被募集并极化为M2表型。我们分离并纯化了高转移性细胞系，以揭示CRC细胞在转移过程中的潜在变化。通过批量RNA测序，我们鉴定并验证了CXCL16是肝转移CT26-LM细胞中诱导M2样KC表型的阳性介质。敲低CXCL16减少了KCs的M2极化，并抑制了肝转移灶的形成。接下来，该极化过程被证明是通过PI3K/AKT/FOXO3a通路实现的。进一步研究发现，FOXO3a在此过程中转录激活CD206（MRC1）。药理学抑制CXCL16-PI3K-FOXO3a轴以干扰KCs极化，在体内减轻了CRC肝转移。我们的研究结果共同表明，靶向KCs中的CXCL16/PI3K/AKT/FOXO3a通路可能是预防CRC肝转移的一种有前景的治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 肝转移性结直肠癌细胞如何通过影响Kupffer细胞的极化来促进肝转移定植？
- 核心机制
- 肿瘤来源的CXCL16通过CXCR6激活KCs中的PI3K/AKT1/FOXO3a通路，FOXO3a转录激活CD206（MRC1），促进KCs向M2表型极化，进而逆转肿瘤细胞的EMT（促进MET），实现肝转移定植。
- 主要证据
- 体内小鼠模型、共培养系统、RNA-seq、qRT-PCR、Western blot、ELISA、双荧光素酶报告基因和ChIP实验证明CXCL16分泌及信号通路作用；敲低CXCL16或使用ML339/LY294002抑制该通路可减少M2极化和肝转移负担。
- 研究意义
- 研究提示CXCL16可能作为转移的预后生物标志物，并可作为肝转移性结直肠癌的潜在治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
共培养实验验证KCs对CRC细胞EMT逆转
验证M2样KCs能否通过分泌因子逆转CRC细胞的EMT，促进MET。
用TGF-β1诱导CT26和MC38发生EMT，加入M2-KCs条件培养基，检测EMT标志物（E-cadherin、ZO-1、N-cadherin、Vimentin）的表达变化。
分离CT26-LM细胞并鉴定关键因子
鉴定促进KCs M2极化的肿瘤源性因子。
从肝转移小鼠肝组织中分离纯化CT26-LM细胞，通过RNA-seq比较CT26、CT26-LM和共培养的CT26（co-CT26）的基因表达，结合生信和实验验证，筛选出关键细胞因子CXCL16。
敲低CXCL16验证其功能
验证CXCL16是否调控KCs极化和肝转移形成。
用shRNA敲低CT26中CXCL16，检测细胞增殖、迁移和极化共培养体系中的M2标志物；体内注射CXCL16敲低细胞观察肝转移灶数目。
验证CXCL16通过PI3K/AKT/FOXO3a通路促进M2极化
确定CXCL16促进KCs M2极化的下游信号通路。
用重组CXCL16、LM-CM、ML339（CXCR6抑制剂）、LY294002（PI3K抑制剂）处理KCs，Western blot检测M2标志物和通路蛋白磷酸化水平。
验证FOXO3a转录调控CD206
验证FOXO3a是否直接结合并激活CD206表达。
通过JASPAR预测FOXO3a结合位点，构建野生型或突变型CD206启动子报告质粒，进行双荧光素酶报告实验和ChIP实验。
体内药理学抑制验证治疗潜力
验证抑制CXCL16/PI3K信号是否能减轻肝转移。
在肝转移模型中，分别给予ML339或LY294002治疗，观察肝转移灶数量、肝脏重量、巨噬细胞浸润和极化标志物。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
验证机制链路
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Solarbio | -- |
| RPMI-1640培养基 | Servicebio | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 药物处理 | 重组小鼠TGF-β1 | Biolegend | -- |
| 重组小鼠CXCL16蛋白 | Absin | -- | |
| ML339 | Macklin | -- | |
| LY294002 | Macklin | -- | |
| 条件培养基制备 | 磷酸盐缓冲液 | -- | -- |
| 0.2微米滤器 | Millipore | -- | |
| 共培养 | 0.4 µm孔径细胞小室 | LABSELECT | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | CWBIO | -- |
| RNA测序 | Illumina NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- |
| qRT-PCR | NanoDrop One分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| SweScript All-in-One RT SuperMix试剂盒 | Servicebio | -- | |
| 2 × SYBR Green qPCR Master Mix | Servicebio | -- | |
| QuantStudio™ 5实时荧光定量PCR仪 | Thermo Fisher | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Solarbio | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Epizyme | -- | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| β-tubulin抗体 | Proteintech | 80713-1-RR | |
| GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| 免疫印迹/荧光 | CD206抗体 | Abcam | ab300621 |
| iNOS抗体 | Beyotime | AF7281 | |
| Arg1抗体 | Beyotime | AF1381 | |
| Western blot | E-cadherin抗体 | Beyotime | AG1547 |
| Vimentin抗体 | Beyotime | AG3556 | |
| ZO-1抗体 | Servicebio | GB111402 | |
| CXCL16抗体 | Servicebio | GB111441 | |
| HRP标记二抗 | Proteintech | -- | |
| SuperKine™ West Femto超敏底物 | Abbkine | -- | |
| 免疫组化/荧光 | F4/80抗体 | Servicebio | GB113373 |
| 免疫组化 | DAB显色液 | Servicebio | G1212 |
| 免疫荧光 | CoraLite594标记山羊抗兔IgG | Proteintech | SA00013-4 |
| CoraLite488标记山羊抗兔IgG | Proteintech | SA00013-2 | |
| DAPI | Beyotime | -- | |
| Transwell迁移实验 | 8 µm孔径Transwell小室 | Labselect | -- |
| CCK-8实验 | CCK-8试剂盒 | Epizyme | -- |
| ELISA | 小鼠CXCL16 ELISA试剂盒 | Elabscience | -- |
| SpectraMax M5酶标仪 | Molecular Devices | -- | |
| 双荧光素酶报告实验 | pEGFP-N1（Foxo3-P2A-EGFP）质粒 | -- | -- |
| pRL-SV40质粒 | -- | -- | |
| 报告基因裂解液 | Beyotime | -- | |
| 双荧光素酶检测试剂盒 | Beyotime | -- | |
| ChIP | ChIP试剂盒 | BersinBio | -- |
| FOXO3a抗体 | Huabio | -- | |
| DNA纯化试剂盒 | Beyotime | -- | |
| 转染 | Lipo8000™转染试剂 | Beyotime | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | 小鼠品系、年龄、性别、注射细胞数量和细胞系 阅读提示：Methods: Animals, Establishment of the colorectal cancer liver metastasis mouse model |
| 细胞培养 | 细胞系来源、培养基类型、血清浓度、培养条件 阅读提示：Methods: Cell culture and reagents |
| 条件培养基制备 | 细胞接种密度、孵育时间、血清饥饿时长、收集方法 阅读提示：Methods: Extraction of conditioned media and co-culture system assays |
| 共培养 | 肿瘤细胞与KCs的比例、共培养时间、小室孔径 阅读提示：Methods: Extraction of conditioned media and co-culture system assays |
| 肝转移细胞分离 | 胶原酶类型、浓度、消化时间、离心速度 阅读提示：Methods: Isolation and purification of liver metastatic cells |
| qRT-PCR | RNA提取方法、逆转录试剂、SYBR Green master mix、仪器型号、内参基因、引物序列 阅读提示：Methods: Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) and Table 1 |
| Western blot | 抗体稀释比、抗体品牌/型号、显色底物、内参蛋白 阅读提示：Methods: Western blot |
| 免疫组化/荧光 | 抗体、抗原修复方法、显色试剂 阅读提示：Methods: Immunofluorescent staining and immunohistochemistry staining |
| 细胞功能实验 | Transwell迁移实验的细胞数、迁移时间；划痕愈合实验的细胞数、孵育时间；CCK-8检测时间点 阅读提示：Methods: Transwell migration assay, Wound healing assay and CCK-8 assay |
| ELISA | 试剂盒品牌、检测样本类型、孵育时间 阅读提示：Methods: Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) |
| 双荧光素酶报告实验 | 转染的质粒、细胞密度、转染后时间、裂解和检测方法 阅读提示：Methods: Dual-luciferase reporter assay |
| ChIP | 抗体、免疫沉淀条件、引物 阅读提示：Methods: Chromatin immunoprecipitation (ChIP) |
| 体内药物干预 | 药物名称、剂量、给药频率、对照组 阅读提示：Results: Inhibition of CXCL16/PI3K/AKT1 signaling pathway attenuates CRC liver metastasis |