样本收集与分组
获取ACL不同临床形式及健康对照的皮肤活检样本，用于后续分析。
收集20例ACL患者皮肤活检（ADCL 5例、LCL La 4例、LCL Lb 6例、MCL 5例）及6例健康皮肤活检。
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美洲皮肤利什曼病不同临床形式中炎症小体的转录组学和免疫病理学特征
Transcriptomic and Immunopathological Profiles of Inflammasomes in Different Clinical Forms of American Cutaneous Leishmaniasis.
实验完整度
高包含患者病灶样本的转录组学（RNA-seq）和免疫组化验证，并结合组织病理学分析，形成多个独立证据层级。
主要模型
皮肤活检组织（ACL患者） 健康皮肤活检组织（对照组）
重点核对
临床分组：ADCL（5例）、LCL（La）（4例）、LCL（Lb）（6例）、MCL（5例）及健康对照（6例） RNA-seq样本：总RNA 500 ng，TruSeq Stranded Total RNA文库，Illumina HiSeq 2000平台 免疫组化：10个显微镜视野/切片，细胞密度计算基于视野面积0.036852 mm² 统计分析：单因素ANOVA，Shapiro-Wilk正态性检验，Dunn或Tukey事后检验，显著性水平p≤0.05
摘要
美洲皮肤利什曼病（ACL）由利什曼原虫（Leishmania）亚马逊亚种和巴西亚种引起，临床表现和免疫病理学表现谱广泛，从局限性皮肤利什曼病（LCL）到严重的无反应性弥漫性皮肤利什曼病（ADCL）和黏膜皮肤利什曼病（MCL）。尽管有证据表明免疫反应复杂，但炎症小体在疾病严重程度和寄生虫持续存在中的作用仍不清楚。我们研究了患者病灶中炎症小体组分在临床谱系中的转录组学和免疫病理学特征。与健康对照相比，ACL中NLRP3、AIM2、NLRP12、NLRC4、CASP1、CASP5、GSDMD和IL1B等基因以及所有评估的蛋白均显示更高表达。观察到不同的炎症小体激活模式：高反应性形式MCL显示NLRP3、AIM2和IL-1β升高，表明炎症环境加剧。低反应性形式ADCL显示NLRP12和NLRC4表达增加，GSDMD降低。局限性形式显示过渡性特征，突出了ACL的多因素发病机制。这些发现增进了我们对ACL中炎症小体机制的理解，确定了调节炎症和改善管理的潜在治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 在ACL的不同临床形式中，炎症小体组分（NLRP3、AIM2、NLRP12、NLRC4、CASP1、CASP5、GSDMD、IL-1β、IL-18）的转录和蛋白表达是否呈现不同模式，及其与疾病严重程度和寄生虫持续存在的关系。
- 核心机制
- 高反应性MCL表现为NLRP3、AIM2和IL-1β高表达，提示加剧炎症反应；低反应性ADCL表现为NLRP12、NLRC4高表达而GSDMD低表达，可能涉及免疫逃逸机制导致寄生虫持续存在。
- 主要证据
- 基于患者病灶的RNA-seq转录组分析显示NLRP3、AIM2、IL1B在MCL中高表达，免疫组化验证显示MCL中NLRP3+、AIM2+、IL-1β+细胞密度高，ADCL中NLRP12+、NLRC4+细胞密度高而GSDMD+细胞密度低。
- 研究意义
- 研究增进了对炎症小体在ACL临床-免疫病理谱系中作用的理解，并指出针对NLRP3或IL-1β的靶向治疗可能是改善MCL过度炎症的潜在策略，但需进一步研究。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
组织病理学分析
评估不同临床形式病灶的炎症浸润、细胞类型和寄生虫负荷。
皮肤组织经HE染色，使用光学显微镜进行详细的组织病理学评估，记录炎症浸润类型和分布、主要细胞类型、肉芽肿存在与否及寄生虫证据。
转录组分析
检测炎症小体相关基因在ACL不同临床形式的表达差异。
从皮肤活检中提取总RNA，构建全转录组文库，进行RNA-seq，分析NLRP3、AIM2、NLRP12、NLRC4、CASP1、CASP5、GSDMD、IL1B、IL18等基因的表达。
免疫组化分析
验证转录组发现，评估炎症小体蛋白在组织中的原位表达和细胞密度。
对石蜡组织切片进行免疫组化染色，使用抗NLRP3、AIM2、NLRC4、NLRP12、caspase-1、caspase-5、GSDMD、IL-1β、IL-18抗体，定量分析免疫阳性细胞密度。
数据整合与相关性分析
分析炎症小体基因之间的相关性，并整合转录组和蛋白表达数据，解释临床表型差异。
对转录组数据进行差异表达分析和Spearman相关性分析，结合免疫组化结果，比较不同临床形式的炎症小体激活模式。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 组织病理学 | Axioskop 2 Plus Zeiss光学显微镜 | Zeiss | -- |
| 免疫组织化学 | 抗NLRP3抗体 | Elabscience | E-AB-70161 |
| 抗AIM2抗体 | Elabscience | E-AB-10974 | |
| 抗NLRC4抗体 | Elabscience | E-AB-67860 | |
| 抗NLRP12抗体 | Elabscience | E-AB-66298 | |
| 抗caspase-1抗体 | Sigma Aldrich | G6231-3D2 | |
| 抗caspase-5抗体 | Cloud-clone Corp. | MAA770Hu22 | |
| 抗GSDMD抗体 | Elabscience | E-AB-81473 | |
| 抗IL-1β抗体 | Abcam | ab2105 | |
| 抗IL-18抗体 | Abcam | ab68435 | |
| NOVOLINK聚合物检测系统 | Leica Biosystems | RE7280-K | |
| DAB + H2O2显色底物 | DakoCytomation | K3468 | |
| 免疫组化定量分析 | Axiovision 4.8软件 | Zeiss | -- |
| 转录组 | RNAlater | Invitrogen | -- |
| RNAeasy Mini试剂盒 | Qiagen | -- | |
| TruSeq链特异性总RNA文库制备试剂盒（含Ribo-Zero Gold） | Illumina | -- | |
| Illumina HiSeq 2000测序仪 | Illumina | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本收集 | 临床分组（ADCL、LCL La、LCL Lb、MCL）及样本量（5、4、6、5）；健康对照来源（非流行区整形手术剩余皮肤） 阅读提示：见Materials and Methods的Samples部分（2.1节） |
| 组织病理学 | 染色方法（HE）、显微镜型号 阅读提示：见Materials and Methods的Histopathology部分（2.2节） |
| 免疫组织化学 | 一抗稀释比（如NLRP3 1:600, AIM2 1:100等）、抗原修复条件（缓冲液和温度时间）、检测系统（NOVOLINK） 阅读提示：见Materials and Methods的Immunohistochemistry部分（2.3节） |
| 免疫组化定量分析 | 显微镜视野数量（10）、视野面积（0.036852 mm²） 阅读提示：见Materials and Methods的Quantitative Analysis部分（2.4节） |
| 转录组分析 | RNA提取试剂盒（RNAeasy Mini kit）、文库构建试剂盒（TruSeq Stranded Total RNA）、测序平台（HiSeq 2000）、RNA用量（500 ng） 阅读提示：见Materials and Methods的Transcriptome部分（2.5节） |