体外抗炎活性筛选
评估NJ-1A和Nar对LPS诱导的BV-2小胶质细胞促炎因子释放的影响
LPS诱导BV-2细胞，NJ-1A（5、10、25 μg/mL）和Nar（2.5、5、10 μM）预处理30分钟，检测NO、IL-6、TNF-α水平及iNOS蛋白和mRNA表达
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甘松提取物和甘松酮通过抑制葡萄糖代谢重编程和调节T细胞浸润发挥神经保护作用
Nardostachys jatamansi Extract and Nardosinone Exert Neuroprotective Effects by Suppressing Glucose Metabolic Reprogramming and Modulating T Cell Infiltration.
实验完整度
高体外BV-2细胞模型和体内MPTP/p小鼠模型两个独立证据层级，包含功能验证（细胞因子、代谢、迁移）和机制验证（AKT/mTOR通路、MHCII表达）。
主要模型
LPS诱导的BV-2小胶质细胞 MPTP/p诱导的C57BL/6N小鼠慢性帕金森病模型
重点核对
LPS诱导BV-2细胞，Nar浓度2.5、5、10 μM，NJ-1A浓度5、10、25 μg/mL，预处理30分钟 MPTP/p小鼠模型：MPTP 30 mg/kg腹腔注射，丙磺舒250 mg/kg，给药频率每3.5天一次，共5周 体内给药剂量：Nar 16和80 mg/kg，NJ-1A 10和100 mg/kg，腹腔注射 转板迁移实验：CTLL-2细胞，BV-2条件培养基，迁移24小时 MHY1485（mTOR激动剂）逆转NJ-1A和Nar对NO、CCL5、CXCL10的抑制
摘要
背景：甘松（Nardostachys jatamansi DC.），一种在传统中药中广泛使用的草药，历来用于治疗多种神经精神疾病。甘松酮（Nar），一种倍半萜类化合物，已被确定为甘松的主要活性成分之一。本研究利用体外和体内实验模型，研究了甘松乙酸乙酯提取物（NJ-1A）及其活性成分甘松酮对神经炎症介质释放、葡萄糖代谢重编程和T细胞迁移的影响。方法：采用脂多糖（LPS）诱导的BV-2小胶质细胞和1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶/丙磺舒（MPTP/p）诱导的雄性C57BL/6N小鼠慢性帕金森病模型。结果：NJ-1A和Nar均能显著抑制LPS诱导的小胶质细胞M1促炎因子或标志物的产生，并能通过AKT/mTOR信号通路抑制糖酵解过程，促进氧化磷酸化。此外，它们能够减弱活化小胶质细胞的趋化因子释放，从而减少T细胞迁移。体内实验表明，NJ-1A和Nar有效抑制MPTP诱导小鼠黑质中的小胶质细胞活化，减少T细胞浸润，并减轻酪氨酸羟化酶（TH）阳性多巴胺能神经元的损失。结论：NJ-1A和甘松酮通过调节小胶质细胞极化状态、调控代谢重编程和抑制T细胞浸润发挥神经保护作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 甘松提取物NJ-1A及其活性成分甘松酮能否通过调节小胶质细胞葡萄糖代谢重编程和抑制T细胞浸润发挥神经保护作用？
- 核心机制
- NJ-1A和Nar通过抑制AKT/mTOR信号通路，抑制LPS诱导的BV-2小胶质细胞糖酵解并促进氧化磷酸化，减少趋化因子（CCL2、CCL5、CCL12、CXCL10）和MHCII表达，从而减少T细胞迁移和浸润，最终保护多巴胺能神经元。
- 主要证据
- 体外实验显示NJ-1A和Nar降低促炎因子（NO、IL-6、TNF-α）和iNOS表达，抑制糖酵解酶（GLUT1、HK2、PKM2）mRNA，降低ECAR、升高OCR，减少ROS，并通过AKT/mTOR通路抑制趋化因子和MHCII；体内实验显示药物抑制MPTP小鼠黑质中小胶质细胞活化（IBA-1、iNOS、MHCII），减少CD4+和CD8+ T细胞浸润，并恢复TH阳性神经元。
- 研究意义
- 本研究提供直接证据表明，通过传统草药提取物逆转小胶质细胞葡萄糖代谢重编程和破坏活化小胶质细胞与浸润T细胞之间的神经退行性免疫枢纽，可有效发挥神经保护作用，为帕金森病治疗提供了新思路。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
氧化应激检测
验证NJ-1A和Nar对LPS诱导的BV-2细胞ROS产生的影响
DCFH-DA探针染色，流式细胞术和荧光显微镜检测ROS水平
NF-κB信号通路检测
探究NJ-1A和Nar对LPS诱导的NF-κB激活的影响
Western blot检测IκB-α和p65的磷酸化水平，免疫荧光验证p65磷酸化
代谢重编程检测
评估NJ-1A和Nar对LPS诱导的BV-2细胞糖酵解和氧化磷酸化的影响
Seahorse XF96检测ECAR和OCR，RT-PCR检测糖酵解酶GLUT1、HK2、PKM2的mRNA表达
趋化因子和T细胞迁移检测
验证NJ-1A和Nar抑制活化小胶质细胞趋化因子分泌和T细胞迁移的能力
蛋白芯片检测25种趋化因子，RT-PCR验证CXCL10、CCL2、CCL12、CCL5，Transwell迁移实验评估CTLL-2细胞迁移，RT-PCR检测CTLL-2表达CXCR3和CCR5
MHCII表达检测
探究NJ-1A和Nar对LPS诱导的BV-2细胞MHCII表达的影响
流式细胞术检测MHCII表达
AKT/mTOR信号通路验证
验证NJ-1A和Nar是否通过AKT/mTOR通路抑制炎症和趋化因子分泌
Western blot检测AKT和mTOR磷酸化，使用mTOR激动剂MHY1485进行逆转实验，检测NO、CCL5、CXCL10分泌和mTOR磷酸化
体内神经保护评估
评估NJ-1A和Nar对MPTP/p诱导的慢性帕金森病小鼠模型的神经保护作用
MPTP/p诱导慢性模型，药物处理5周，检测TH表达和TH阳性细胞数量，转棒实验评价运动功能
体内小胶质细胞活化和T细胞浸润评估
验证NJ-1A和Nar对MPTP小鼠脑内小胶质细胞活化和T细胞浸润的抑制
Western blot检测IBA-1、iNOS、MHCII，免疫荧光检测IBA-1，免疫组化/免疫荧光计数CD4+和CD8+ T细胞
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证分子表达变化
验证代谢通路
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | 甘松酮 | Chengdu Purifa Technology Co., Ltd. | 23720-80-1 |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Viva Cell | -- | |
| 阳性对照 | 米诺环素 | Sigma-Aldrich | -- |
| 细胞活力检测 | CCK-8检测试剂盒 | Beyotime Biotechnology | C0037 |
| NO检测 | 一氧化氮检测试剂盒 | Beyotime Biotechnology | S0021S |
| 细胞因子检测 | TNF-α ELISA试剂盒 | R&D Systems | MTA00B |
| IL-6 ELISA试剂盒 | R&D Systems | M6000B | |
| 趋化因子检测 | 小鼠趋化因子芯片试剂盒 | R&D Systems | ARY020 |
| CCL5 ELISA试剂盒 | elabscience | E-EL-M0009c | |
| CXCL10 ELISA试剂盒 | elabscience | E-EL-M0021 | |
| RT-PCR | RT-PCR试剂盒 | Applied Biosystems | A25742 |
| ROS检测 | DCFH-DA探针 | -- | -- |
| 代谢分析 | XF-96细胞外流量分析仪 | Agilent | 103020-100 |
| 葡萄糖 | Agilent | -- | |
| 寡霉素 | Agilent | -- | |
| 2-脱氧-D-葡萄糖 | Agilent | -- | |
| FCCP | Agilent | -- | |
| Western blot | β-actin抗体 | Cell Signaling Technology | 3700S |
| p65抗体 | Cell Signaling Technology | 8242S | |
| p-p65抗体 | Cell Signaling Technology | 3033S | |
| iκB-α抗体 | Cell Signaling Technology | 4812S | |
| p-iκB-α抗体 | Cell Signaling Technology | 2859S | |
| mTOR抗体 | Cell Signaling Technology | 29182S | |
| AMPK抗体 | Cell Signaling Technology | 5831S | |
| p-AMPK抗体 | Cell Signaling Technology | 2535S | |
| TH抗体 | Cell Signaling Technology | 58844S | |
| Iba-1抗体 | Cell Signaling Technology | 17198S | |
| iNOS抗体 | Thermo Fisher Scientific | 14-5920-82 | |
| 免疫荧光/免疫组化 | CD4抗体 | Thermo Fisher Scientific | 14-0041-82 |
| CD8抗体 | Thermo Fisher Scientific | 14-0081-82 | |
| 二抗 | ZSGB-BIO | ZLI-9018 | |
| 动物实验 | MPTP | -- | -- |
| 丙磺舒 | -- | -- | |
| 玉米油 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体外细胞培养与处理 | BV-2细胞来源、培养条件（DMEM+10%FBS+1%双抗）、LPS浓度、药物预处理时间（30分钟）、处理时间（8或24小时）、细胞密度 阅读提示：参见2.3节 Cell Culture and Treatment 及图例 |
| 代谢分析 | ECAR和OCR检测时的细胞密度、底物浓度（葡萄糖、寡霉素、2-DG、FCCP、鱼藤酮/抗霉素A）、处理时间 阅读提示：参见2.7节 EACR and OCR |
| 趋化因子和T细胞迁移 | BV-2条件培养基的制备、CTLL-2细胞密度、迁移时间（24小时）、迁移细胞计数方法（流式） 阅读提示：参见2.9节 及图6图例 |
| 体内动物模型 | 小鼠品系、性别、周龄、体重、每组只数、MPTP和丙磺舒剂量、给药频率（每3.5天）和周期（5周）、药物剂量（Nar 16和80 mg/kg；NJ-1A 10和100 mg/kg）、给药途径（腹腔注射） 阅读提示：参见2.10节 MPTP/p-Induced Chronic Mouse Parkinson Model and Treatment |
| 免疫组化/免疫荧光 | 脑组织固定、切片厚度（40 μm）、使用的抗体（TH、Iba-1、CD4、CD8）及浓度（文中未明确说明） 阅读提示：参见2.11节 及图9-11图例 |