建立A-431单层和RVE培养
比较单层和RVE的细胞分化程度，确定最佳实验模型
将A-431细胞以4×10^5细胞/mL接种于24孔板，培养1天（单层）或5天（RVE），每3天换液，部分加入SVF。检测细胞角蛋白5/6表达。
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白色念珠菌作为单纯疱疹病毒2型在体外重建人阴道上皮感染中的先行者
Candida albicans as a Trailblazer for Herpes Simplex Virus-2 Infection Against an In Vitro Reconstituted Human Vaginal Epithelium.
实验完整度
中包含体外细胞模型（A-431 RVE）、真菌和病毒载量测定、细胞损伤、氧化应激和细胞因子检测，但缺乏体内模型或患者样本验证。
主要模型
A-431细胞单层 A-431细胞重建阴道上皮（RVE）
重点核对
细胞培养条件（DMEM，10% FBS生长培养基，5% FBS维持培养基） 感染复数（C. albicans MOI 0.5:1，HSV-2 MOI 0.1:1） 感染时间（3小时预孵育，总24小时） SVF浓度（10% v/v） 检测方法（CFU、RT-PCR、LDH、MitoSOX、ELISA）
摘要
关于多微生物感染中宿主-病原体和病原体-病原体相互作用的复杂事件知之甚少。使用采用A-431细胞系并补充合成阴道液（SVF）的体外重建阴道上皮（RVE）模型，我们研究了白色念珠菌和/或单纯疱疹病毒2型（HSV-2）单感染与双重感染的后果。我们的数据显示：(a) RVE中分化标志物细胞角蛋白5/6的表达显著增强，且受SVF增强；(b) 白色念珠菌在双重感染模型中增强HSV-2，在SVF存在时病毒滴度几乎翻倍；(c) RVE损伤（>20%），主要归因于白色念珠菌，且与氧化应激相关，无论SVF是否存在；(d) 粘蛋白-1的失调，其产生在响应SVF或感染时分别增强（从13至21 ng/mL）或受损（从21至10 ng/mL）；以及(e) RVE的细胞因子反应部分至可忽略，取决于SVF的存在。总之，使用通过添加合成阴道液升级的体外RVE模型，我们提供了上皮细胞-病原体-病原体相互作用的细节，有助于更好地理解粘膜水平多微生物感染的发病机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 在体外重建阴道上皮模型中，白色念珠菌和HSV-2双重感染如何相互影响，以及SVF的存在如何调节这种相互作用？
- 核心机制
- C. albicans通过消耗SVF中的营养物质，可能恢复适合病毒复制条件，从而增强HSV-2复制；同时C. albicans诱导上皮损伤和氧化应激，并下调粘蛋白-1。
- 主要证据
- 在SVF存在下，双重感染中HSV-2 DNA拷贝数几乎翻倍（RT-PCR和空斑实验）；LDH释放显示C. albicans导致>20%细胞损伤；MitoSOX显示双重感染时ROS产生加倍；ELISA显示C. albicans降低粘蛋白-1水平。
- 研究意义
- 该模型有助于理解粘膜多微生物感染的发病机制，为改进诊断和治疗策略提供基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
单感染和双重感染
评估白色念珠菌和HSV-2单独或共同感染对RVE的影响
感染前更换维持培养基，部分加SVF。加入C. albicans（MOI 0.5:1），3小时后加入HSV-2（MOI 0.1:1），总培养24小时。
检测病原体载量
定量白色念珠菌和HSV-2在单感染和双重感染中的生长
收集细胞裂解液，C. albicans用CFU法计数，HSV-2用RT-PCR和空斑实验定量。
评估细胞损伤
量化单感染和双重感染诱导的上皮细胞损伤
使用LDH释放试剂盒检测细胞损伤百分比，部分实验用MTT验证。
测定氧化应激
检测感染后线粒体ROS的产生
感染后加入MitoSOX™ Red（2.5 μM），用Fluoroskan在37°C连续监测24小时，计算AUC。
检测分泌因子
量化促炎细胞因子和粘蛋白-1的产生
收集24小时无细胞上清，用ELISA检测IL-1α、IL-1β、IL-8和粘蛋白-1。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Sial S.r.l. | -- |
| L-谷氨酰胺 | Gibco | -- | |
| 青链霉素 | Lonza | -- | |
| 环丙沙星 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | Sial S.r.l. | -- | |
| 真菌培养 | 沙氏葡萄糖肉汤 | Condalab | -- |
| YPD培养基 | Scharlab | -- | |
| IHC染色 | 抗细胞角蛋白5/6小鼠单克隆抗体 | Roche Diagnostics-Ventana | clone D5/16B4 |
| Ventana OptiView通用DAB免疫组化检测试剂盒 | Roche Diagnostics-Ventana | -- | |
| 细胞损伤检测 | 乳酸脱氢酶检测试剂盒 | Roche | -- |
| Triton X-100 | Fluka Chemicals | -- | |
| 氧化应激检测 | MitoSOX红色探针 | Invitrogen | -- |
| ELISA | IL-1α ELISA试剂盒 | PeproTech | -- |
| IL-1β ELISA试剂盒 | Invitrogen | -- | |
| IL-8 ELISA试剂盒 | Invitrogen | -- | |
| 粘蛋白-1 ELISA试剂盒 | Elabscience | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | A-431细胞代数（30-40代），培养基成分（DMEM、L-谷氨酰胺、青链霉素、环丙沙星、FBS浓度），培养时间（1天单层，5天RVE），SVF添加（10% v/v） 阅读提示：Methods 2.1, 2.4, 2.6 |
| 感染条件 | C. albicans MOI 0.5:1，HSV-2 MOI 0.1:1，预孵育3小时，总感染24小时 阅读提示：Methods 2.6 |
| 病原体载量检测 | C. albicans CFU计数方法，HSV-2 RT-PCR和空斑实验具体条件 阅读提示：Methods 2.8 |
| 细胞损伤检测 | LDH释放检测步骤，高对照裂解剂（1% Triton X-100），计算方式 阅读提示：Methods 2.7 |
| 氧化应激检测 | MitoSOX浓度（2.5 μM），检测时间（24小时），激发/发射波长（544/590 nm），AUC计算 阅读提示：Methods 2.9 |