生物信息学分析
鉴定差异表达基因和相关信号通路，探索AMPK/NF-κB/SHP1/SHP2/STING通路的关联。
从GEO下载GSE44037数据集，包含5个AR样本和6个健康对照，用limma包识别差异表达基因（|log2FC|>1, P<0.05），进行GO和KEGG富集分析，并计算基因间相关性。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
人胎盘提取物通过调节AMPK/SHP1/SHP2/STING信号通路抑制过敏性鼻炎
Treatment with human placental extracts inhibits allergic rhinitis by modulating AMPK/SHP1/SHP2/STING signaling.
实验完整度
高包含生物信息学分析、OVA诱导的大鼠AR模型、体内HPE干预和AMPK抑制剂处理、体外巨噬细胞模型、Western blot和ELISA验证。
主要模型
OVA诱导的过敏性鼻炎SD大鼠模型 LPS和IFN-γ诱导的肺泡巨噬细胞模型 GSE44037数据集
重点核对
OVA致敏和激发方案：腹腔注射0.3 mg OVA和30 mg Al(OH)3，第1、3、5、7、9、11、13天；第15-17天鼻内给予50 mg/ml OVA 20 μl/只，第18-21天给予100 mg/ml OVA 20 μl/只。 HPE处理：模型+HPE组腹腔注射5 ml/kg HPE，第28-46天；模型+HPE+AMPK抑制剂组静脉注射10 mg/kg AMPK抑制剂和腹腔注射5 ml/kg HPE，第28-46天。 细胞处理：LPS 1 μg/ml、IFN-γ 20 ng/ml、HPE 40 ng/ml、AMPK抑制剂dorsomorphin 2HCl 5 μM、NSC-87877 5 μM、DMXAA 100 μg/ml，处理24小时。 样本量：每组8只大鼠；细胞实验重复三次。 统计方法：one-way ANOVA和Tukey's HSD post hoc检验，P<0.05为差异显著。
摘要
本研究旨在探讨人胎盘提取物（HPE）对卵清蛋白（OVA）诱导的过敏性鼻炎（AR）大鼠和细胞模型的调节作用及机制。IFN-γ和LPS诱导AR体外模型。将32只雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠随机分为以下四组：Sham组、模型组、模型+HPE组和模型+HPE+AMPK抑制剂组（每组n=8只大鼠）。除Sham组外，其余三组用OVA致敏建立AR模型，随后给予各种处理。采用苏木精和伊红染色观察鼻黏膜形态学变化，ELISA检测血清中IL-1β、干扰素（IFN）β、免疫球蛋白（Ig）E、IgG1和IgG2a水平，Western blotting评估各组蛋白表达。Sham组组织结构完整，无明显病理改变。模型组表现出明显的病理特征，包括大量炎性细胞浸润、组织脱落和水肿。模型+HPE组显示组织结构逐渐恢复，水肿和炎性浸润减轻，而模型+HPE+AMPK抑制剂组再次出现明显炎性细胞浸润等病理表现。与假手术组相比，模型组血清IL-1β、IFNβ、IgE、IgG1和IgG2a水平升高。模型+HPE组IL-1β、IFNβ、IgE、IgG1和IgG2a水平低于模型组。此外，模型+HPE+AMPK抑制剂组IL-1β、IFNβ、IgE、IgG1和IgG2a水平高于模型+HPE组。与Sham组相比，模型组p-AMPK/t-AMPK、p-SHP1/t-SHP1和p-SHP2/t-SHP2表达水平降低，而p-STING/t-STING和p-TBK1/t-TBK1表达水平升高。与模型组相比，模型+HPE组p-AMPK/t-AMPK、p-SHP1/t-SHP1和p-SHP2/t-SHP2表达增强，而p-STING/t-STING和p-TBK1/t-TBK1表达降低。相反，与模型+HPE组相比，模型+HPE+AMPK抑制剂组p-AMPK/t-AMPK、p-SHP1/t-SHP1和p-SHP2/t-SHP2表达降低，而p-STING/t-STING和p-TBK1/t-TBK1表达升高。总之，HPE可能通过调节AMPK/SHP1/SHP2/STING信号通路抑制AR。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 人胎盘提取物（HPE）能否抑制卵清蛋白（OVA）诱导的过敏性鼻炎（AR），其机制是否涉及AMPK/SHP1/SHP2/STING信号通路？
- 核心机制
- HPE通过激活AMPK，进而促进NF-κB，上调SHP1和SHP2表达，抑制STING和TBK1，从而抑制STING/TBK1介导的炎症反应；在炎症状态下，ROS抑制AMPK，P53抑制SHP1/2，解除对STING/TBK1的抑制，加重炎症。
- 主要证据
- OVA诱导的AR大鼠模型显示HPE减轻鼻黏膜病理损害，降低血清IL-1β、IFNβ、IgE、IgG1和IgG2a水平；Western blot显示HPE增加p-AMPK/t-AMPK、p-SHP1/t-SHP1、p-SHP2/t-SHP2，降低p-STING/t-STING、p-TBK1/t-TBK1；使用AMPK抑制剂可逆转这些效应。体外巨噬细胞模型中，HPE减少NOX4、NLRP3、IFNβ表达，减轻迁移，AMPK抑制剂、NSC-87877（SHP1/2抑制剂）和DMXAA（STING激动剂）逆转HPE的作用。
- 研究意义
- 本研究为过敏性鼻炎提供了潜在的治疗靶点，HPE可能作为多靶点天然化合物用于长期和个性化治疗，但需要临床研究进一步验证。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
大鼠AR模型建立和HPE干预
验证HPE对OVA诱导的AR大鼠的治疗作用，并探究AMPK信号的作用。
32只SD大鼠随机分为Sham、模型、模型+HPE、模型+HPE+AMPK抑制剂四组（每组8只）。除Sham组外，其余组用OVA致敏和激发建立AR模型。模型+HPE组腹腔注射HPE（5 ml/kg），模型+HPE+AMPK抑制剂组静脉注射AMPK抑制剂（10 mg/kg）和腹腔注射HPE（5 ml/kg），第28-46天。
鼻黏膜组织病理学分析
评估HPE对OVA诱导的鼻黏膜形态学损伤的缓解作用。
分离鼻黏膜组织，固定、包埋、切片，进行H&E染色，观察组织学改变。
血清炎症因子和免疫球蛋白检测
评估HPE对AR大鼠血清中炎症因子和抗体水平的影响。
收集腹主动脉血，离心分离血清，用ELISA试剂盒检测IL-1β、IFNβ、IFNα、MDA、SOD、IgE、IgG1、IgG2a和GSH水平。
Western blot检测鼻黏膜蛋白表达
验证HPE对AMPK/SHP1/SHP2/STING通路蛋白表达的影响。
裂解鼻黏膜组织，提取蛋白，BCA定量，SDS-PAGE电泳，转移至PVDF膜，孵育特异性一抗和二抗，ECL显色，检测p-AMPK/t-AMPK、p-SHP1/t-SHP1、p-SHP2/t-SHP2、p-STING/t-STING、p-TBK1/t-TBK1。
肺泡巨噬细胞分离和鉴定
建立体外细胞模型，以研究HPE对巨噬细胞炎症反应的直接作用。
从正常大鼠肺泡灌洗液中分离肺泡巨噬细胞，通过CD68免疫荧光鉴定，培养于含10% FBS和1%青霉素/链霉素的DMEM中。
细胞模型分组和处理
在体外验证HPE对LPS和IFN-γ诱导的巨噬细胞炎症的影响，并探究AMPK、SHP1/2、STING的作用。
将巨噬细胞分为6组：NC、LPS+IFN-γ、LPS+IFN-γ+HPE、LPS+IFN-γ+HPE+AMPK抑制剂、LPS+IFN-γ+HPE+NSC-87877、LPS+IFN-γ+HPE+DMXAA，处理24小时。收集细胞裂解液和上清进行后续检测。
细胞蛋白表达和炎症因子检测
评估HPE对巨噬细胞炎症相关蛋白和氧化应激指标的影响。
Western blot检测NOX4、p-AMPK/t-AMPK、p-SHP1/t-SHP1、p-SHP2/t-SHP2、p-STING/t-STING、p-TBK1/t-TBK1、NLRP3、IFNβ的表达；ELISA检测上清中IL-1β、IFNβ、IFNα、MDA、SOD、GSH水平。
Transwell细胞迁移实验
评估HPE对巨噬细胞迁移能力的影响，探讨其在鼻黏膜重塑中的作用。
将巨噬细胞接种于Transwell上室，下室加入含10% FBS的DMEM，培养24小时后，固定、染色，显微镜下计数迁移细胞。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc. | -- |
| 胎牛血清 | Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc. | -- | |
| 青霉素/链霉素溶液 | Beyotime Institute of Biotechnology | C0222 | |
| 胎牛血清 | Beyotime Institute of Biotechnology | C0226 | |
| 动物模型构建 | 卵清蛋白 | MilliporeSigma | -- |
| 氢氧化铝 | -- | -- | |
| 人胎盘提取物 | Handan Kangye Pharmaceutical Co., Ltd. | -- | |
| AMPK抑制剂dorsomorphin 2HCl | Beijing Baiolaibo Technology Co., Ltd. | -- | |
| 细胞处理 | NSC-87877 | MedChemExpress | -- |
| DMXAA | MedChemExpress | -- | |
| ELISA | IL-1β ELISA试剂盒 | Beyotime | PI303 |
| IFNβ ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-R0545 | |
| IFNα ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-R3036 | |
| MDA ELISA试剂盒 | Beyotime | S0131S | |
| SOD ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-R1424 | |
| IgE ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-R0517 | |
| IgG1 ELISA试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 88-50500-88 | |
| IgG2a ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-R2415 | |
| GSH ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-0026 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime Institute of Biotechnology | P0013B |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| ECL检测试剂盒 | Beyotime Institute of Biotechnology | P0018M | |
| p-AMPK抗体 | Abcam | ab133448 | |
| t-AMPK抗体 | Abcam | ab32047 | |
| p-STING抗体 | Abcam | ab318182 | |
| t-STING抗体 | Abcam | ab227128 | |
| p-TBK1抗体 | CST | 5483 | |
| t-TBK1抗体 | CST | 38066 | |
| p-SHP1抗体 | CST | 47696 | |
| t-SHP1抗体 | CST | 26516 | |
| p-SHP2抗体 | CST | 5431 | |
| t-SHP2抗体 | CST | 3397 | |
| NOX4抗体 | Beyotime | AF1498 | |
| NLRP3抗体 | Abcam | ab263899 | |
| IFNβ抗体 | Beyotime Institute of Biotechnology | AF7170 | |
| GAPDH抗体 | Abcam | ab181602 | |
| 山羊抗兔IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6721 | |
| 免疫荧光 | CD68抗体 | Abcam | ab955 |
| FITC标记二抗 | Abcam | ab150113 | |
| DAPI染色液 | -- | -- | |
| Transwell实验 | Transwell小室 | Beijing Baiolaibo Technology Co., Ltd. | -- |
| Western blot | Western blot电泳设备 | Shanghai Sevier Technology Co., Ltd. | -- |
| 细胞分离 | 裂解液 | Beyotime Institute of Biotechnology | C3702 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 大鼠AR模型建立 | OVA剂量和给药方案；HPE和AMPK抑制剂的剂量、给药途径和时间；大鼠品系、性别、周龄、体重和饲养条件。 阅读提示：Methods: Construction of a rat model of AR |
| 细胞模型建立和处理 | 肺泡巨噬细胞的分离方法和培养条件；LPS、IFN-γ、HPE、AMPK抑制剂、NSC-87877、DMXAA的浓度和处理时间；细胞分组。 阅读提示：Materials and methods: Cell model construction and grouping |
| 蛋白表达检测 | Western blot的抗体稀释比例、蛋白上样量、凝胶浓度；ELISA试剂盒的具体货号和检测指标。 阅读提示：Materials and methods: Western blot analysis of protein expression in the nasal mucosa; ELISA |
| 组织病理学评估 | 鼻黏膜组织的固定、包埋、切片厚度；H&E染色的具体步骤和试剂。 阅读提示：Materials and methods: Hematoxylin and eosin (H&E) staining of morphological changes in nasal mucosa |
| 统计设计 | 每组样本量；实验重复次数；统计方法和显著性水平。 阅读提示：Materials and methods: Statistical analysis |