构建铜死亡相关预后模型
识别与GBM预后相关的铜死亡特征基因
使用TCGA和CGGA数据,经差异表达分析和LASSO回归构建风险评分模型,并在验证集中验证。
Targeting the cuproptosis‑associated gene COL22A1 in glioblastoma using EMD‑1204831 and kaempferol.
包含生物信息学分析(TCGA、CGGA、GEO、CellMiner)、多组学验证(免疫浸润、DNA甲基化、突变)、单细胞测序、分子对接、细胞功能实验(CCK-8、克隆形成)、机制验证(Western blot、ROS、铜浓度、电镜)及体内动物模型(皮下及颅内移植瘤)。
LN229细胞系 A172细胞系 293T细胞系 BALB/c裸鼠皮下及颅内移植瘤模型
GBM细胞系LN229和A172,来自ATCC shRNA靶序列:shCOL22A1-1和shCOL22A1-2 药物浓度:kaempferol 80 µM,EMD-1204831 9 µM,elesclomol 200 nM 小鼠模型:5×10^6 LN229细胞颅内注射,药物剂量EMD-1204831 10 mg/kg,kaempferol 20 mg/kg
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
识别与GBM预后相关的铜死亡特征基因
使用TCGA和CGGA数据,经差异表达分析和LASSO回归构建风险评分模型,并在验证集中验证。
验证预后模型与免疫浸润、DNA突变和甲基化的关联
使用Cibersort分析免疫浸润,ChAMP分析甲基化,maftools分析体细胞突变,并比较高低风险组差异。
分析风险评分相关基因在GBM组织不同细胞类型中的表达和动态变化
对GSE100675数据集进行聚类和拟时序分析,评估不同细胞簇的风险评分,并追踪基因表达轨迹。
筛选潜在治疗药物并预测靶点
利用CellMiner数据库筛选与风险评分相关的药物,并通过网络药理学和分子对接分析,确定COL22A1为山柰酚靶点。
评估COL22A1敲低或药物处理对GBM细胞增殖和铜死亡的影响
使用shRNA敲低COL22A1,通过CCK-8、克隆形成、ROS检测、铜浓度测定、Western blot和电镜观察细胞变化。
评估EMD-1204831和山柰酚联合治疗对GBM移植瘤生长的抑制作用
使用BALB/c裸鼠建立皮下和颅内移植瘤模型,分组给药,监测肿瘤体积和重量,并进行Ki67和H&E染色。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc. | -- |
| 胎牛血清 | Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc. | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc. | -- | |
| 转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | -- |
| pLKO.1载体 | Addgene, Inc. | 8453 | |
| psPAX2包装质粒 | Addgene, Inc. | 8454 | |
| PMD2.G包膜质粒 | Addgene, Inc. | 12260 | |
| 聚凝胺 | MilliporeSigma | -- | |
| 嘌呤霉素 | MilliporeSigma | -- | |
| 药物处理 | 山柰酚 | MedChemExpress | HY-14590 |
| EMD-1204831 | MedChemExpress | HY-164394 | |
| 埃乐司莫 | MedChemExpress | HY-12040 | |
| 对照处理 | 二甲基亚砜 | MedChemExpress | HY-Y0320 |
| 细胞增殖检测 | CCK-8试剂 | Merck KGaA | -- |
| VersaMax酶标仪 | Molecular Devices, LLC | -- | |
| 电镜样本处理 | 醋酸铀 | -- | -- |
| 电镜 | HT-7700透射电子显微镜 | -- | -- |
| 免疫组化 | Ki67抗体 | Cell Signaling Technology, Inc. | 9027 |
| ROS检测 | ROS检测试剂盒 | Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc. | C10445 |
| ROS荧光探针 | Beyotime Institute of Biotechnology | S0033S | |
| 流式分析 | BD LSRFortessa流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| Flowjo v9软件 | BD Biosciences | -- | |
| 铜浓度测定 | 铜检测试剂盒 | Elabscience Bionovation Inc. | E-BC-K775-M |
| 蛋白提取 | RIPA裂解液 | Beyotime Institute of Biotechnology | P0013C |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 23225 |
| Western blot | 牛血清白蛋白 | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | A8020 |
| COL22A1抗体 | Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc. | PA5-70816 | |
| DLAT抗体 | Proteintech Group, Inc. | 13426-1-AP | |
| DLST抗体 | Abcam | ab177934 | |
| FDX1抗体 | Proteintech Group, Inc. | 12592-1-AP | |
| ACTB抗体 | Abcam | ab8226 | |
| GAPDH抗体 | Proteintech Group, Inc. | 60004-1-Ig | |
| HRP标记二抗(抗小鼠IgG) | Abcam | ab7068 | |
| HRP标记二抗(抗兔IgG) | Abcam | ab288151 | |
| ECL化学发光试剂盒 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 322209 | |
| BIO-RAD ChemiDoc MP化学发光成像仪 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与转染 | 细胞系LN229、A172、293T;培养基DMEM+10%FBS+1%双抗;shCOL22A1序列;转染试剂Lipofectamine 2000;病毒包装质粒比例 阅读提示:详见Materials and methods中的Cell culture和Transfection部分 |
| 药物处理与细胞功能 | kaempferol浓度、EMD-1204831浓度、elesclomol浓度、处理时间、DMSO对照 阅读提示:详见Materials and methods中的CCK-8 assay、Colony formation assay和Results中药物处理部分 |
| 铜死亡检测 | ROS检测试剂盒、铜浓度测定试剂盒、CuCl2浓度、elesclomol浓度、流式细胞仪设置、Western blot抗体稀释比例 阅读提示:详见Materials and methods中的ROS assay、Measurement of intracellular copper和Western blotting部分 |
| 体内动物实验 | 小鼠品系、年龄、性别、数量、细胞注射量、立体定位坐标、药物剂量、给药频率、肿瘤体积测量间隔、麻醉方法 阅读提示:详见Materials and methods中的Mice部分 |