靶向胶质母细胞瘤中铜死亡相关基因COL22A1:使用EMD-1204831和山柰酚

Targeting the cuproptosis‑associated gene COL22A1 in glioblastoma using EMD‑1204831 and kaempferol.

作者信息Yi Chen, Ye Zhang, Huilan Yang, Qiang Liu, Rui Sui, Ji Shi, Haiyang Liang, Jia Liu, Huizhe Xu, Haozhe Piao
PMID40242972
发布时间2025-05
DOI10.3892/ijo.2025.5744

实验完整度

包含生物信息学分析(TCGA、CGGA、GEO、CellMiner)、多组学验证(免疫浸润、DNA甲基化、突变)、单细胞测序、分子对接、细胞功能实验(CCK-8、克隆形成)、机制验证(Western blot、ROS、铜浓度、电镜)及体内动物模型(皮下及颅内移植瘤)。

主要模型

LN229细胞系 A172细胞系 293T细胞系 BALB/c裸鼠皮下及颅内移植瘤模型

重点核对

GBM细胞系LN229和A172,来自ATCC shRNA靶序列:shCOL22A1-1和shCOL22A1-2 药物浓度:kaempferol 80 µM,EMD-1204831 9 µM,elesclomol 200 nM 小鼠模型:5×10^6 LN229细胞颅内注射,药物剂量EMD-1204831 10 mg/kg,kaempferol 20 mg/kg

摘要

胶质母细胞瘤(GBM)是一种高发病率且预后不良的疾病。中西医结合治疗和铜死亡已知在GBM的治疗中发挥重要作用。然而,通过中西医结合靶向铜死亡来治疗GBM尚未得到广泛研究。因此,本研究主要关注基于铜死亡的GBM诊断和治疗。通过生物信息学方法,首先构建了铜死亡相关的预后模型。接下来,通过多组学分析发现该预后模型与免疫浸润、DNA突变和DNA甲基化密切相关。本研究基于基因表达综合数据库来源的单细胞测序数据,表明了GBM组织中的细胞簇及各簇的风险评分。值得注意的是,通过筛选CellMiner数据库,发现EMD-1204831与风险评分表现出高度相关性。接下来,通过网络药理学和分子对接分析,风险评分相关基因胶原蛋白XXII型α1链(COL22A1)被确定为山柰酚的靶点,山柰酚是人参的活性成分。值得注意的是,在细胞实验中,山柰酚通过抑制COL22A1表达可以降低GBM细胞的增殖。最后,在细胞和动物实验中,山柰酚和EMD-1204831对GBM的生长有明显抑制作用,并通过COL22A1使GBM对铜死亡诱导剂敏感。总的来说,本研究揭示了一种基于铜死亡的GBM联合治疗方案。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
探讨铜死亡在胶质母细胞瘤(GBM)诊断和治疗中的作用,并寻找基于铜死亡的中西医结合治疗方案。
核心机制
COL22A1是铜死亡相关预后模型的靶基因,山柰酚和EMD-1204831通过抑制COL22A1表达,增强GBM细胞对铜死亡诱导剂的敏感性,从而抑制肿瘤生长。
主要证据
生信分析构建模型并验证;细胞实验显示COL22A1敲低或药物联合处理降低增殖和集落形成,增加ROS和铜浓度,并降低FDX1表达;动物实验中联合用药显著抑制肿瘤生长。
研究意义
本研究提供了基于铜死亡相关基因的GBM预后模型,并提出了山柰酚(人参活性成分)与EMD-1204831联合治疗GBM的潜在策略,为中西医结合治疗GBM提供了理论基础。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

构建铜死亡相关预后模型

识别与GBM预后相关的铜死亡特征基因

使用TCGA和CGGA数据,经差异表达分析和LASSO回归构建风险评分模型,并在验证集中验证。

2

多组学特征分析

验证预后模型与免疫浸润、DNA突变和甲基化的关联

使用Cibersort分析免疫浸润,ChAMP分析甲基化,maftools分析体细胞突变,并比较高低风险组差异。

3

单细胞RNA测序分析

分析风险评分相关基因在GBM组织不同细胞类型中的表达和动态变化

对GSE100675数据集进行聚类和拟时序分析,评估不同细胞簇的风险评分,并追踪基因表达轨迹。

4

药物敏感性分析与分子对接

筛选潜在治疗药物并预测靶点

利用CellMiner数据库筛选与风险评分相关的药物,并通过网络药理学和分子对接分析,确定COL22A1为山柰酚靶点。

5

体外验证COL22A1功能与药物效应

评估COL22A1敲低或药物处理对GBM细胞增殖和铜死亡的影响

使用shRNA敲低COL22A1,通过CCK-8、克隆形成、ROS检测、铜浓度测定、Western blot和电镜观察细胞变化。

6

体内验证联合治疗效果

评估EMD-1204831和山柰酚联合治疗对GBM移植瘤生长的抑制作用

使用BALB/c裸鼠建立皮下和颅内移植瘤模型,分组给药,监测肿瘤体积和重量,并进行Ki67和H&E染色。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
DMEM培养基Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.--
胎牛血清Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.--
青霉素-链霉素Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.--
Lipofectamine 2000转染试剂Thermo Fisher Scientific, Inc.--
pLKO.1载体Addgene, Inc.8453
psPAX2包装质粒Addgene, Inc.8454
PMD2.G包膜质粒Addgene, Inc.12260
聚凝胺MilliporeSigma--
嘌呤霉素MilliporeSigma--
山柰酚MedChemExpressHY-14590
EMD-1204831MedChemExpressHY-164394
埃乐司莫MedChemExpressHY-12040
二甲基亚砜MedChemExpressHY-Y0320
CCK-8试剂Merck KGaA--
VersaMax酶标仪Molecular Devices, LLC--
醋酸铀----
HT-7700透射电子显微镜----
Ki67抗体Cell Signaling Technology, Inc.9027
ROS检测试剂盒Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.C10445
ROS荧光探针Beyotime Institute of BiotechnologyS0033S
BD LSRFortessa流式细胞仪BD Biosciences--
Flowjo v9软件BD Biosciences--
铜检测试剂盒Elabscience Bionovation Inc.E-BC-K775-M
RIPA裂解液Beyotime Institute of BiotechnologyP0013C
BCA蛋白定量试剂盒Thermo Fisher Scientific, Inc.23225
牛血清白蛋白Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.A8020
COL22A1抗体Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.PA5-70816
DLAT抗体Proteintech Group, Inc.13426-1-AP
DLST抗体Abcamab177934
FDX1抗体Proteintech Group, Inc.12592-1-AP
ACTB抗体Abcamab8226
GAPDH抗体Proteintech Group, Inc.60004-1-Ig
HRP标记二抗(抗小鼠IgG)Abcamab7068
HRP标记二抗(抗兔IgG)Abcamab288151
ECL化学发光试剂盒Thermo Fisher Scientific, Inc.322209
BIO-RAD ChemiDoc MP化学发光成像仪Bio-Rad Laboratories, Inc.--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
细胞培养与转染
细胞系LN229、A172、293T;培养基DMEM+10%FBS+1%双抗;shCOL22A1序列;转染试剂Lipofectamine 2000;病毒包装质粒比例
阅读提示:详见Materials and methods中的Cell culture和Transfection部分
药物处理与细胞功能
kaempferol浓度、EMD-1204831浓度、elesclomol浓度、处理时间、DMSO对照
阅读提示:详见Materials and methods中的CCK-8 assay、Colony formation assay和Results中药物处理部分
铜死亡检测
ROS检测试剂盒、铜浓度测定试剂盒、CuCl2浓度、elesclomol浓度、流式细胞仪设置、Western blot抗体稀释比例
阅读提示:详见Materials and methods中的ROS assay、Measurement of intracellular copper和Western blotting部分
体内动物实验
小鼠品系、年龄、性别、数量、细胞注射量、立体定位坐标、药物剂量、给药频率、肿瘤体积测量间隔、麻醉方法
阅读提示:详见Materials and methods中的Mice部分