建立细胞和动物模型
构建糖尿病肾病细胞和动物模型，以模拟疾病状态。
HK-2细胞在高糖（25 mmol/L）DMEM中培养72小时建立细胞模型；SD大鼠通过高脂高糖饮食和注射STZ（40 mg/kg）建立DN模型，血糖>16.7 mmol/L视为成功。
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胰激肽原酶通过Notch1/Hes1/Pten/Akt信号通路对糖尿病肾病诱导的纤维化的影响研究
Study on effect of pancreatic kininogenase on diabetic nephropathy-induced fibrosis via Notch1/Hes1/Pten/Akt signaling pathway.
实验完整度
高包含细胞和动物两个独立证据层级，并通过Western blot、RT-qPCR、免疫荧光、免疫组化、Masson染色等进行了功能与机制验证。
主要模型
人肾小管上皮细胞（HK-2） 糖尿病肾病大鼠模型（STZ诱导）
重点核对
细胞模型：HK-2细胞经高糖（25 mmol/L）处理72小时诱导；PKase浓度为6 pg/mL；Jagged1浓度为10 μM（Med Chem Express, HY-P1846A）。 动物模型：Sprague-Dawley大鼠，HFD饮食，STZ（40 mg/kg）腹腔注射；PKase 6 pg/mL、Jagged1 0.5 mg/kg，处理8周。 分组：体外5组（HK-2、HG、PKase、Jagged1、PKase+Jagged1）；体内5组（Control、Model、PKase、Jagged1、PKase+Jagged1）。 检测指标：血糖、SCr、BUN、TG、TC、24小时尿微量白蛋白；凋亡蛋白Bax/Bcl-2；通路蛋白Notch1、Hes1、Pten、p-Akt；纤维化标志物E-cadherin、vimentin、α-SMA、Collagen I、TGF-β、FN；氧化应激SOD、MDA、ROS。 统计设计：Student's t-test或单因素方差分析（ANOVA），Tukey事后检验；N=3（细胞），N=6（动物）。
摘要
目的：阐明胰激肽原酶（PKase）通过调节Notch1/Hes1和Pten/Akt通路影响糖尿病肾病肾纤维化的机制。方法：本研究采用体内模型和细胞实验来研究PKase对细胞活力、凋亡和氧化应激的影响。使用试剂盒评估这些参数，同时通过Western Blot和RT-qPCR测量蛋白表达水平。使用HE和Masson染色分析肾组织的组织学变化。通过免疫荧光和免疫组织化学评估纤维化标志物，包括E-钙黏蛋白、波形蛋白、α-SMA、I型胶原、TGF-β和纤连蛋白。结果：经PKase治疗八周后，糖尿病肾病大鼠的血糖水平和相关症状显著改善。体内和体外结果均表明，PKase治疗抑制了糖尿病肾病标志物（包括波形蛋白、α-SMA、FN、I型胶原和TGF-β）的表达，同时增加了E-钙黏蛋白的表达。此外，Notch1、Hes1和磷酸化Akt（p-Akt）的表达上调，而Pten的表达被抑制，所有这些均被PKase治疗逆转。此外，两项分析均表明PKase减轻了Jagged1诱导的凋亡和氧化应激，并缓解了肾小管间质纤维化。结论：PKase似乎通过激活Pten/Akt通路和抑制Notch1/Hes1通路来改善糖尿病肾病诱导的肾纤维化，表明其作为糖尿病肾病治疗药物的潜力。临床试验编号：不适用。补充信息：在线版本包含补充材料，可在10.1186/s12882-025-04050-1获取。关键词：PKase，糖尿病肾病，肾纤维化，Notch1/Hes1通路，Pten/Akt通路
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 胰激肽原酶是否通过调节Notch1/Hes1和Pten/Akt信号通路影响糖尿病肾病诱导的肾纤维化？
- 核心机制
- PKase通过抑制Notch1/Hes1信号通路，进而激活Pten/Akt信号通路，从而改善细胞凋亡和氧化应激，减轻肾纤维化。
- 主要证据
- 体外HK-2细胞和体内STZ诱导的DN大鼠模型中，PKase处理后Notch1、Hes1、p-Akt表达降低，Pten表达升高；纤维化标志物（vimentin、α-SMA、Collagen I、TGF-β、FN）下调，E-cadherin上调；凋亡和氧化应激减轻。
- 研究意义
- PKase可能作为糖尿病肾病的治疗药物，通过调节Notch1/Hes1-Pten/Akt通路发挥抗纤维化作用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估细胞活力、凋亡和氧化应激
验证PKase对细胞活力和凋亡的影响，以及Jagged1的干预作用。
CCK-8检测细胞活力；流式细胞术（Annexin-V-FITC/PI）检测凋亡率；Western blot检测凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达。
检测纤维化标志物表达
评估PKase对纤维化相关蛋白表达的影响。
通过免疫荧光检测HK-2细胞中E-cadherin、vimentin、α-SMA、Collagen I、TGF-β和FN的表达；通过免疫组化检测肾组织中的这些蛋白。
分析信号通路蛋白表达
研究PKase对Notch1/Hes1和Pten/Akt信号通路的影响。
Western blot和RT-qPCR检测Notch1、Hes1、Pten、Akt、p-Akt的表达水平。
评估肾功能和组织病理变化
验证PKase对DN大鼠肾功能和肾脏组织病理的改善作用。
生化分析仪检测血糖、SCr、BUN、TG、TC和24小时尿微量白蛋白；HE染色观察肾组织病理。
检测凋亡和氧化应激相关指标
研究PKase对肾组织凋亡和氧化应激的影响。
Western blot检测肾组织中Bax和Bcl-2的表达；试剂盒检测血清中SOD、MDA和ROS水平。
评估肾纤维化程度
通过Masson染色和免疫组化评估肾纤维化的改善。
Masson染色观察胶原沉积；免疫组化检测纤维化标志物。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM/F-12培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 药物处理 | 胰激肽原酶 | Shanghai, Kanglang | -- |
| Jagged1 | Med Chem Express | HY-P1846A | |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | Med Chem Express | SF4139-10mM |
| 细胞凋亡检测 | Annexin-V-FITC/PI凋亡检测试剂盒 | Elabscience | E-CK-A211 |
| FITC结合缓冲液 | AmyJet | -- | |
| 流式分析 | 流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- |
| 免疫荧光 | Triton X-100 | Shanghai Lianmai Biological Engineering Co., LTD | -- |
| 抗E-钙黏蛋白抗体 | Fien Biology Technology | -- | |
| 抗波形蛋白抗体 | Omer Biotechnology | -- | |
| 抗α-SMA抗体 | BioLayb Biotechnology | -- | |
| 抗I型胶原抗体 | Qincheng Biotechnology | -- | |
| 抗TGF-β抗体 | Abcam | -- | |
| 抗兔二抗 | Abcam | abs50029 | |
| DAPI染色液 | Servicebio | -- | |
| 抗荧光淬灭封片剂 | Xinbosheng Biotechnology | -- | |
| 荧光显微镜 | KEYENCE | -- | |
| 动物实验 | 异氟烷 | Sigma | 792632 |
| 氧气 | Sigma | 851086 | |
| 链脲佐菌素 | Solarbio | S8050 | |
| 柠檬酸钠缓冲液 | -- | -- | |
| 肾功能检测 | 生化分析仪 | Seamaty | -- |
| 氧化应激检测 | SOD检测试剂盒 | Science Ab Co., Ltd | -- |
| MDA检测试剂盒 | Seapea BioTech Co., Ltd | -- | |
| ROS检测试剂盒 | Shanghai Fanrui BioTech Co., Ltd | -- | |
| 组织病理 | Masson染色试剂盒 | -- | -- |
| 图像分析 | ImageJ软件 | NIH | -- |
| 免疫组化 | 牛血清白蛋白 | Aiyan | -- |
| 尼康TS2显微镜 | Nikon | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | mlbio | -- | |
| PVDF膜 | Sigma-Aldrich | IPFL00010 | |
| 脱脂奶粉 | -- | -- | |
| ECL检测试剂盒 | TW-reagent | -- | |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Applygen | R1030 |
| cDNA合成试剂盒 | Vazyme | -- | |
| SYBR Green PCR预混液 | Phygene | PH0120 | |
| Applied Biosystems 7300序列检测系统 | HZbiotech | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与模型建立 | HK-2细胞来源（SNL-165, SUNNCELL）；培养条件（DMEM/F-12, 10% FBS, 100 U/mL青霉素-链霉素, 37°C, 5% CO2）；高糖诱导浓度和时间（25 mmol/L, 72小时）；PKase和Jagged1处理浓度（PKase 6 pg/mL, Jagged1 10 μM）。 阅读提示：Methods: Cell culture |
| 细胞活力与凋亡检测 | CCK-8检测时间点（0、24、48小时）；细胞接种密度（5×10^3 cells/well）；流式细胞术细胞密度（1×10^6 cells/mL）和染色步骤。 阅读提示：Methods: CCK-8, Flow cytometry |
| 动物模型建立与分组 | 动物品系、性别、年龄和体重（6-8周龄雄性SD大鼠，约200g）；HFD饮食；STZ剂量（40 mg/kg）和给药方式（腹腔注射）；建模成功标准（血糖>16.7 mmol/L）；PKase和Jagged1剂量（PKase 6 pg/mL, Jagged1 0.5 mg/kg）及给药时间（8周）。 阅读提示：Methods: Animal experiment |
| 肾功能和氧化应激检测 | 生化分析仪检测的指标（SCr, BUN, TG, TC, 24小时尿微量白蛋白）；SOD、MDA、ROS检测试剂盒及操作流程。 阅读提示：Methods: Assessment of renal function, Oxidative stress |
| 组织病理和纤维化分析 | HE和Masson染色的组织固定、包埋、切片厚度（4 μm）；免疫组化中抗原修复、封闭、一抗和二抗孵育条件；ImageJ软件分析。 阅读提示：Methods: HE staining, Masson's staining, Immunohistochemistry |
| 蛋白和基因表达检测 | Western blot中蛋白提取（RIPA）、定量（BCA）、电泳和转膜条件；RT-qPCR中RNA提取、逆转录、SYBR Green预混液和引物序列（Notch1, Hes1, Pten, Akt, GAPDH）。 阅读提示：Methods: Western blot, RT-qPCR |