临床样本分析
评估CYP1B1-AS1在脓毒症患者中的表达水平及其与疾病严重程度和预后的相关性。
纳入116例脓毒症患者和92例对照,检测血清CYP1B1-AS1水平,分析其与临床指标(SOFA、APACHE II、炎症因子)的相关性,并通过ROC和Kaplan-Meier分析评估诊断和预后价值。
LncRNA CYP1B1-AS1 as a clinical biomarker exacerbates sepsis inflammatory response via targeting miR- 18a- 5p.
包含临床队列分析、体外细胞模型、功能验证(siRNA沉默)和机制验证(双荧光素酶、RIP、RNA pull-down),证据层级至少两个。
LPS刺激的THP-1细胞 脓毒症患者血清样本 GSE217700数据库全血样本
LPS浓度:1 µg/ml LPS处理时间:24小时 si-CYP1B1-AS1浓度:50 mg/ml(应为50 nM,但原文如此) miR-18a-5p inhibitor浓度:50 nM 转染试剂:Lipofectamine 3000
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估CYP1B1-AS1在脓毒症患者中的表达水平及其与疾病严重程度和预后的相关性。
纳入116例脓毒症患者和92例对照,检测血清CYP1B1-AS1水平,分析其与临床指标(SOFA、APACHE II、炎症因子)的相关性,并通过ROC和Kaplan-Meier分析评估诊断和预后价值。
验证CYP1B1-AS1对LPS诱导的THP-1细胞凋亡和炎症反应的影响。
使用1 µg/ml LPS处理THP-1细胞24小时建立脓毒症模型,转染si-CYP1B1-AS1沉默CYP1B1-AS1,检测细胞凋亡和炎症因子水平。
验证CYP1B1-AS1与miR-18a-5p的直接结合关系。
通过双荧光素酶报告基因、RIP和RNA pull-down实验验证CYP1B1-AS1与miR-18a-5p的靶向结合。
验证miR-18a-5p在CYP1B1-AS1介导的凋亡和炎症中的作用。
在LPS诱导的THP-1细胞中,共转染si-CYP1B1-AS1和miR-18a-5p inhibitor,检测细胞凋亡和炎症因子水平。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Gibco | 11875093 |
| 胎牛血清 | Sigma Aldrich | F8318-500ML | |
| 青霉素/链霉素 | Invitrogen | 15140155 | |
| 药物处理 | 脂多糖 | Sigma Aldrich | L4391 |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | L000015 |
| RNA提取 | GenElute总RNA纯化试剂盒 | Sigma Aldrich | RNB100-50RXN |
| miRNeasy血清/血浆试剂盒 | Qiagen | 217184 | |
| RNA定量 | NanoDrop 2000分光光度计 | Thermo Fisher | -- |
| cDNA合成 | PrimeScript RT试剂盒 | Takara Biotechnology | RR047 |
| TaqMan miRNA逆转录试剂盒 | Life Technologies | 4366597 | |
| RT-qPCR | SYBR Green qPCR预混液试剂盒 | ThermoFisher Scientific | K0221 |
| ABI 7500荧光定量PCR仪 | Applied Biosystems | -- | |
| 细胞凋亡检测 | Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒 | Elabscience | E-CK-211 |
| 流式分析 | BD/FACS Aria II流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| ELISA | TNF-α ELISA试剂盒 | Invitrogen | KAC1751 |
| IL-6 ELISA试剂盒 | Invitrogen | KRC0061 | |
| IL-8 ELISA试剂盒 | Invitrogen | KHC0081 | |
| IL-1β ELISA试剂盒 | Invitrogen | KAC1211 | |
| 亚细胞定位 | PARIS试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | AM1921 |
| 双荧光素酶报告实验 | 双荧光素酶报告系统 | Promega | E1910 |
| RIP实验 | EZ-MAGNA RIP试剂盒 | Millipore | 17-701 |
| RNA pull-down实验 | M-280链霉亲和素磁珠 | Invitrogen | 112.05D |
| 生化指标检测 | Beckman Coulter IMMAGE800检测仪 | Beckman Coulter | -- |
| 血常规检测 | Sysmex XN2000全自动血液分析仪 | Sysmex | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床样本收集与处理 | 脓毒症患者和对照的纳入排除标准、血清分离条件(12,000 rpm, 15分钟)、储存温度(-80℃) 阅读提示:Materials and methods: Participants, Data collection |
| 细胞培养与处理 | THP-1细胞培养基、LPS浓度(1 µg/ml)、处理时间(24小时)、培养条件(37℃) 阅读提示:Materials and methods: Cell culture and treatment |
| 细胞转染 | si-CYP1B1-AS1和miR-18a-5p inhibitor浓度(50 mg/ml和50 nM,注意单位可能笔误)、转染试剂(Lipofectamine 3000)、转染时间(8小时) 阅读提示:Materials and methods: Cell transfection |
| RT-qPCR | RNA提取试剂盒、cDNA合成试剂盒、qPCR程序(95℃ 5分钟预变性,40个循环95℃ 10秒、60℃ 30秒)、内参基因(GAPDH和U6) 阅读提示:Materials and methods: RNA extraction and RT-qPCR |
| 凋亡和炎症检测 | 凋亡检测试剂盒(Annexin V-FITC/PI)、ELISA试剂盒(TNF-α, IL-6, IL-8, IL-1β)、重复数(三次) 阅读提示:Materials and methods: Cell apoptosis assay, ELISA |
| 机制验证 | 双荧光素酶报告质粒(WT和MUT)、RIP试剂盒(EZ-MAGNA RIP)、RNA pull-down探针(Bio-miR-18a-5p) 阅读提示:Materials and methods: Luciferase reporter assay, RIP, RNA pull-down |