长链非编码RNA CYP1B1-AS1作为临床生物标志物通过靶向miR-18a-5p加重脓毒症炎症反应

LncRNA CYP1B1-AS1 as a clinical biomarker exacerbates sepsis inflammatory response via targeting miR- 18a- 5p.

作者信息Lixia Xu, Jingpo Li, Li Li, Qiushuang Zhang, Qiuju Feng, Lijie Bai
PMID40234801
发布时间2025-04-16
DOI10.1186/s12865-025-00712-9

实验完整度

包含临床队列分析、体外细胞模型、功能验证(siRNA沉默)和机制验证(双荧光素酶、RIP、RNA pull-down),证据层级至少两个。

主要模型

LPS刺激的THP-1细胞 脓毒症患者血清样本 GSE217700数据库全血样本

重点核对

LPS浓度:1 µg/ml LPS处理时间:24小时 si-CYP1B1-AS1浓度:50 mg/ml(应为50 nM,但原文如此) miR-18a-5p inhibitor浓度:50 nM 转染试剂:Lipofectamine 3000

摘要

背景:脓毒症以高发病率和死亡率为特征,需要识别新的诊断和预后生物标志物以改善患者预后。先前研究强调了长链非编码RNA在脓毒症中的潜在临床效用。本研究旨在探讨血清lncRNA CYP1B1-AS1表达在脓毒症中的临床意义和潜在机制。方法:通过GEO数据库探索脓毒症患者中差异表达的lncRNA。纳入脓毒症患者和对照组受试者。使用LPS刺激的THP-1细胞建立体外细胞模型。RT-qPCR评估CYP1B1-AS1和miR-18a-5p的表达。ROC分析评估诊断和预测价值。Kaplan-Meier曲线和Cox回归分析CYP1B1-AS1的预后价值。流式细胞术和ELISA评估细胞凋亡和炎症因子水平。双荧光素酶报告基因、RIP和RNA pull-down验证靶向结合关系。结果:GSE217700数据库显示CYP1B1-AS1在脓毒症中上调。脓毒症患者血清CYP1B1-AS1水平高于对照组。CYP1B1-AS1与SOFA和APACHE II评分正相关,并能区分脓毒症患者与对照组。脓毒症患者28天死亡率为29.31%。脓毒症患者中CYP1B1-AS1高表达预示预后较差,是潜在的危险因素。CYP1B1-AS1靶向miR-18a-5p。沉默CYP1B1-AS1可减少LPS诱导的细胞凋亡和炎症因子促进,而miR-18a-5p抑制剂可逆转该效应。结论:CYP1B1-AS1可作为脓毒症诊断和不良预后的生物标志物,可能通过靶向miR-18a-5p促进炎症和凋亡。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
CYP1B1-AS1在脓毒症中的临床意义及其潜在分子机制是什么?
核心机制
CYP1B1-AS1通过靶向miR-18a-5p促进炎症和凋亡,从而加重脓毒症。
主要证据
临床样本显示CYP1B1-AS1高表达与严重程度和预后不良相关;体外LPS诱导的THP-1细胞中,沉默CYP1B1-AS1降低凋亡和炎症因子,而miR-18a-5p抑制剂逆转该效应;双荧光素酶、RIP和RNA pull-down证实直接结合。
研究意义
CYP1B1-AS1可作为脓毒症诊断和预后预测的生物标志物,为脓毒症治疗提供新见解。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

临床样本分析

评估CYP1B1-AS1在脓毒症患者中的表达水平及其与疾病严重程度和预后的相关性。

纳入116例脓毒症患者和92例对照,检测血清CYP1B1-AS1水平,分析其与临床指标(SOFA、APACHE II、炎症因子)的相关性,并通过ROC和Kaplan-Meier分析评估诊断和预后价值。

2

体外细胞模型建立与功能验证

验证CYP1B1-AS1对LPS诱导的THP-1细胞凋亡和炎症反应的影响。

使用1 µg/ml LPS处理THP-1细胞24小时建立脓毒症模型,转染si-CYP1B1-AS1沉默CYP1B1-AS1,检测细胞凋亡和炎症因子水平。

3

分子机制验证

验证CYP1B1-AS1与miR-18a-5p的直接结合关系。

通过双荧光素酶报告基因、RIP和RNA pull-down实验验证CYP1B1-AS1与miR-18a-5p的靶向结合。

4

回复实验

验证miR-18a-5p在CYP1B1-AS1介导的凋亡和炎症中的作用。

在LPS诱导的THP-1细胞中,共转染si-CYP1B1-AS1和miR-18a-5p inhibitor,检测细胞凋亡和炎症因子水平。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
RPMI-1640培养基Gibco11875093
胎牛血清Sigma AldrichF8318-500ML
青霉素/链霉素Invitrogen15140155
脂多糖Sigma AldrichL4391
Lipofectamine 3000转染试剂InvitrogenL000015
GenElute总RNA纯化试剂盒Sigma AldrichRNB100-50RXN
miRNeasy血清/血浆试剂盒Qiagen217184
NanoDrop 2000分光光度计Thermo Fisher--
PrimeScript RT试剂盒Takara BiotechnologyRR047
TaqMan miRNA逆转录试剂盒Life Technologies4366597
SYBR Green qPCR预混液试剂盒ThermoFisher ScientificK0221
ABI 7500荧光定量PCR仪Applied Biosystems--
Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒ElabscienceE-CK-211
BD/FACS Aria II流式细胞仪BD Biosciences--
TNF-α ELISA试剂盒InvitrogenKAC1751
IL-6 ELISA试剂盒InvitrogenKRC0061
IL-8 ELISA试剂盒InvitrogenKHC0081
IL-1β ELISA试剂盒InvitrogenKAC1211
PARIS试剂盒Thermo Fisher ScientificAM1921
双荧光素酶报告系统PromegaE1910
EZ-MAGNA RIP试剂盒Millipore17-701
M-280链霉亲和素磁珠Invitrogen112.05D
Beckman Coulter IMMAGE800检测仪Beckman Coulter--
Sysmex XN2000全自动血液分析仪Sysmex--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
临床样本收集与处理
脓毒症患者和对照的纳入排除标准、血清分离条件(12,000 rpm, 15分钟)、储存温度(-80℃)
阅读提示:Materials and methods: Participants, Data collection
细胞培养与处理
THP-1细胞培养基、LPS浓度(1 µg/ml)、处理时间(24小时)、培养条件(37℃)
阅读提示:Materials and methods: Cell culture and treatment
细胞转染
si-CYP1B1-AS1和miR-18a-5p inhibitor浓度(50 mg/ml和50 nM,注意单位可能笔误)、转染试剂(Lipofectamine 3000)、转染时间(8小时)
阅读提示:Materials and methods: Cell transfection
RT-qPCR
RNA提取试剂盒、cDNA合成试剂盒、qPCR程序(95℃ 5分钟预变性,40个循环95℃ 10秒、60℃ 30秒)、内参基因(GAPDH和U6)
阅读提示:Materials and methods: RNA extraction and RT-qPCR
凋亡和炎症检测
凋亡检测试剂盒(Annexin V-FITC/PI)、ELISA试剂盒(TNF-α, IL-6, IL-8, IL-1β)、重复数(三次)
阅读提示:Materials and methods: Cell apoptosis assay, ELISA
机制验证
双荧光素酶报告质粒(WT和MUT)、RIP试剂盒(EZ-MAGNA RIP)、RNA pull-down探针(Bio-miR-18a-5p)
阅读提示:Materials and methods: Luciferase reporter assay, RIP, RNA pull-down