建立Fbxw7敲除小鼠模型
验证Fbxw7缺失是否导致NPHP样病理
使用Cdh16Cre小鼠在肾脏上皮细胞中条件性敲除Fbxw7，观察不同年龄（1、3、7、10个月）的病理变化。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
SOX9依赖性纤维化驱动肾单位肾痨的肾功能衰退
SOX9-dependent fibrosis drives renal function in nephronophthisis.
实验完整度
高包含小鼠模型、细胞模型、患者样本及蛋白质组学等多层级证据，并进行了功能验证和机制研究。
主要模型
Cdh16Cre;Fbxw7f/f小鼠 Fbxw7-null mIMCD3细胞 CaggCreERT2;Ift88f/f小鼠 NPHP1缺失患者肾活检样本
重点核对
小鼠模型：Cdh16Cre驱动Fbxw7敲除，观察时间为1、3、7、10个月 药物处理：他莫昔芬诱导CaggCreERT2，剂量6mg/40g体重，连续3天 细胞模型：mIMCD3细胞，Fbxw7敲除克隆，血清饥饿48小时 肾功能指标：血清BUN、肌酐、胱抑素C 纤维化指标：Masson三色染色、COL1A1、α-SMA
摘要
纤维化是多种囊性肾病的关键特征，尤其是常染色体隐性肾脏疾病如肾单位肾痨（NPHP）。然而，其对肾功能衰退的作用及潜在的分子机制仍不清楚。在这里，我们表明肾脏特异性敲除Fbxw7（SCFFBW7 E3泛素连接酶的识别受体）会导致青少年-成人型NPHP样病理，其特征是缓慢进展的皮质髓质囊肿、肾小管变性、严重纤维化和肾功能逐渐丧失。已知的FBW7底物SOX9以及SOX9下游效应因子、强效促纤维化因子WNT4的表达水平在FBW7缺失后升高。在复合突变小鼠中杂合缺失Sox9可使WNT4水平正常化、减少纤维化并保护肾功能，而对囊肿扩张和肾小管变性无显著影响。这些数据表明，FBW7-SOX9-WNT4诱导的纤维化驱动NPHP以及其他可能的常染色体隐性肾脏疾病的肾功能衰退。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 纤维化在肾单位肾痨（NPHP）肾功能衰退中的因果作用及其分子机制是什么？
- 核心机制
- FBW7缺失导致其底物SOX9积累，SOX9上调WNT4，激活SOX9-WNT4轴驱动肾小管间质纤维化，进而导致肾功能下降。
- 主要证据
- 在Fbxw7敲除小鼠模型中，SOX9和WNT4表达升高，杂合缺失Sox9可降低WNT4水平、减轻纤维化并改善肾功能；在NPHP患者活检和Ift88突变小鼠中也观察到SOX9表达升高。
- 研究意义
- 该研究首次证明SOX9-WNT4依赖性纤维化驱动NPHP样病理的肾功能衰退，为治疗NPHP及其他常染色体隐性囊性肾病提供了潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估细胞增殖与死亡
检测囊肿形成是否伴随细胞增殖和死亡变化
通过Ki67、EdU、磷酸化组蛋白H3染色检测增殖，TUNEL染色检测细胞死亡。
分析炎症和纤维化
检测Fbxw7缺失是否引起炎症和纤维化
通过F4/80染色检测巨噬细胞浸润，Masson三色染色、COL1A1和α-SMA免疫荧光检测纤维化。
蛋白质组学分析
鉴定Fbxw7缺失后差异表达蛋白，寻找机制
对Fbxw7-null和野生型mIMCD3细胞进行定量蛋白质组学分析，鉴定显著变化的蛋白。
验证纤毛和TMEM237变化
确认Fbxw7缺失是否导致纤毛缺陷和TMEM237下调
检测小鼠肾脏和细胞中的纤毛长度和数量，以及TMEM237蛋白表达。
验证SOX9和c-MYC的作用
确定SOX9和c-MYC是否介导NPHP样表型
生成Cdh16Cre;Fbxw7f/f;Sox9+/f和Cdh16Cre;Fbxw7f/f;c-Myc+/f小鼠，评估表型变化。
人类样本验证
验证SOX9在人类NPHP中的表达
对NPHP1突变患者肾活检样本和Ift88突变小鼠肾脏进行SOX9染色。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 小鼠模型 | Cdh16Cre小鼠 | Jackson Labs | 012237 |
| Cagg-CreERT2小鼠 | Zimmerman/Jackson Labs | 004682 | |
| Fbxw7f/f小鼠 | Jackson Labs | 017563 | |
| Sox9f/f小鼠 | Jackson Labs | 013106 | |
| c-Mycf/f小鼠 | Cai/MMRC/Jackson Labs | 032046-JAX | |
| Ift88f/f小鼠 | Zimmerman/Jackson Labs | 022409 | |
| RosamT/mG小鼠 | Zimmerman/Jackson Labs | 007676 | |
| 细胞培养 | IMCD3小鼠上皮细胞系 | ATCC | CRL-2123 |
| HEK293T人细胞系 | ATCC | CRL-3216 | |
| 组织处理 | 10%福尔马林 | Sigma-Aldrich | HT501128 |
| 细胞培养 | DMEM/F-12, GlutaMAX™添加剂 | ThermoFisher Scientific | 10565018 |
| DMEM培养基 | Corning | 10-013-CV | |
| 胎牛血清 | Bio-Techne Corporation | S11150 | |
| 胰蛋白酶 | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| 磷酸盐缓冲液 | Corning | 21-040-CV | |
| RNA提取 | Trizol试剂 | ThermoFisher Scientific | 15596026 |
| 肾功能检测 | 小鼠/大鼠胱抑素C定量ELISA试剂盒 | Bio-Techne Corporation | MSCTC0 |
| 尿素氮（BUN）比色检测试剂盒 | Invitrogen | EIABUN | |
| 凋亡检测 | 一步法TUNEL原位凋亡试剂盒（红色，Elab Fluor® 647） | elabscience | E-CK-A324 |
| 免疫荧光 | ProLong™ Diamond抗淬灭封片剂（含DAPI） | Invitrogen™ | P36971 |
| 免疫印迹 | 乙酰化α-微管蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | T6793 |
| 增殖检测 | Ki67抗体 | Abcam | ab15580 |
| 炎症检测 | AF647偶联F4/80抗体 | Invitrogen | MF48021 |
| 免疫荧光 | NKCC2抗体 | ThermoFisher | PA5142445 |
| 增殖检测 | 磷酸化组蛋白H3抗体 | Cell Signaling | 9701 |
| 纤维化检测 | COL1A1抗体 | Cell Signaling | 72026 |
| α-平滑肌肌动蛋白抗体 | Cell Signaling | 19245 | |
| 免疫荧光 | ATP1A1抗体 | Abcam | ab7671 |
| SOX9抗体 | Sigma-Aldrich | AB5535 | |
| 免疫印迹 | c-MYC抗体 | Cell Signaling | 9402 |
| 免疫荧光 | TMEM237抗体 | ThermoFisher | PA5-63013 |
| 荧光素标记的LTA | Vector Laboratories | FL-1321 | |
| Cy5标记的LTA | USBIO | 518482 | |
| 罗丹明标记的DBA | Vector Laboratories | RL-1032-2 | |
| 免疫印迹 | FBW7抗体 | Abnova | H00055294-B01P |
| FBW7抗体 | Bethyl | A301-720A | |
| FBW7抗体 | Bethyl | A301-721A | |
| β-肌动蛋白抗体 | Santa Cruz | sc-47778 | |
| 药物处理 | 他莫昔芬 | Sigma-Aldrich | T5648 |
| 蛋白质组学 | Orbitrap Exploris 480质谱仪 | Thermo | -- |
| UltiMate 3000 RSLCnano系统 | Thermo | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型构建 | 小鼠基因型、Cre驱动方式、年龄时间点 阅读提示：Methods: Mouse models, tissue processing, and serum analysis |
| 肾功能检测 | 血清BUN、肌酐、胱抑素C水平 阅读提示：Methods: Mouse models, tissue processing, and serum analysis; Figure 1C-E |
| 组织学染色 | Masson三色、COL1A1、α-SMA、F4/80染色条件 阅读提示：Methods: Immunofluorescence, TUNEL, and microscopy; Figure 4 |
| 细胞培养与敲除 | mIMCD3细胞培养条件、Fbxw7敲除克隆验证 阅读提示：Methods: Cell culture and generation of Fbxw7-null mIMCD3 cells |
| 蛋白质组学 | 质谱参数、数据归一化和统计阈值 阅读提示：Methods: Proteomic screen in mIMCD3 cells |