样本收集与预处理
获取并保存初乳/乳样本，确保样本质量
收集产后牛初乳或奶，在清洁密封容器中，运输使用冰盒，储存于-20°C，必要时长期保存，并处理前保持低温。
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乳牛初乳和乳蛋白组分的分离、模拟体外胃肠消化、分级以及基于系统生物学的蛋白组学分析方案
Protocol for isolation, fractionation, and system biology-based profiling of gastrointestinal digested dairy colostrum and milk proteome.
实验完整度
中方案包含样本采集、分级、生化定量（Bradford、OPA、NanoDrop）、体外消化、质谱鉴定及生物信息学分析，但核心结果仅展示少数蛋白质和肽的示例数据，未涉及功能或机制验证。
主要模型
牛初乳样本 乳清、FGMP、酪蛋白水解物
重点核对
样本类型：牛初乳、牛乳及可能的其他乳源 分级条件：分为乳清、FGMP、酪蛋白，需确保完全分离 体外消化：使用胃蛋白酶（4%）和胰酶（4%） 水解产物分子量：<3 kDa 质谱鉴定：Orbitrap nano-LC-ESI-MS/MS
摘要
乳牛初乳和乳由乳清、酪蛋白和脂肪组成，因其蛋白质和肽而具有显著的药理特性。本文提出了一种从任何乳源中分离、模拟体外胃肠消化以及分级初乳和乳水解产物的方案。我们还描述了通过纳米液相色谱-电喷雾电离-串联质谱（nano-LC-ESI-MS/MS）鉴定蛋白质和肽，以及对水解产物中存在的蛋白质和肽进行基于系统生物学的计算机分析步骤。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何从乳源初乳和乳中分离、分级并表征蛋白质和肽，为药物发现建立数据库？
- 核心机制
- 方案的核心机制是体外模拟胃肠消化（pepsin和pancreatin）和质谱鉴定，以释放和识别生物活性肽。
- 主要证据
- 示例结果：乳清、FGMP和酪蛋白的水解度分别为23.45%、27.19%、32.14%，肽定量分别为81%、87%、85%，并鉴定出三种牛初乳蛋白（Alpha-amylase、Serum albumin、Keratin 3）及其肽序列，构成初步的肽数据库。
- 研究意义
- 该方案适用于多种乳源，可系统构建蛋白质和肽库，为肽类药物发现研究提供资源。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
样本分级
分离乳清、脂肪（FGMP）和酪蛋白组分
通过离心分离脂肪，收集FGMP；通过透析和酸沉淀分离乳清和酪蛋白。
蛋白定量和SDS-PAGE分析
定量和表征蛋白组分
使用Bradford法测定蛋白浓度，并用SDS-PAGE进行电泳分离和染色。
体外模拟胃肠消化
模拟消化过程，产生肽水解产物
使用胃蛋白酶和胰酶依次消化蛋白样本，并通过超滤回收分子量<3 kDa的肽段。
水解度和肽定量
评估消化效率和肽浓度
采用OPA法测定水解度，使用NanoDrop分光光度计测定肽浓度。
纳米-LC-ESI-MS/MS鉴定
鉴定蛋白质和肽序列
使用Orbitrap高分辨质谱联用nano-LC分离并鉴定水解产物中的蛋白质和肽。
系统生物学分析
功能注释、通路富集、亚细胞定位和蛋白-蛋白相互作用网络构建
利用OmicsBox进行GO和KEGG分析，YLoc预测亚细胞定位，STRING构建PPI网络，并使用ProtParam、ToxinPred、AlgPred等筛选生物活性肽。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 样本处理 | Amicon Ultra离心过滤器（3 kDa截留） | Merck | UFC9003 |
| 透析膜 Spectra/Por 3（截留3.5 kDa） | Carl Roth | 0978.1 | |
| Empore C18固相萃取盘 | Merck | 66888-U | |
| 蛋白定量 | Bio-Rad蛋白测定染料浓缩液 | Bio-Rad | 5000006 |
| Bradford试剂 | Merck | B6916 | |
| 蛋白电泳 | 考马斯亮蓝G-250 | Merck | 1.15444 |
| PageRuler Plus预染蛋白梯（10-250 kDa） | Thermo Fisher Scientific | 26619 | |
| SDS-PAGE试剂盒 | Elabscience | E-IR-R305 | |
| 体外消化 | 胃蛋白酶 | Merck | 10108057001 |
| 胰酶 | Merck | P7545 | |
| 缓冲区 | 磷酸二氢钾 | Merck | 04243 |
| 磷酸氢二钾 | Merck | 60353 | |
| 水解度定量 | 邻苯二甲醛 | Merck | 79760 |
| 硼砂 | Merck | 221732 | |
| 十二烷基硫酸钠 | Merck | 11667289001 | |
| β-巯基乙醇 | Merck | M3148 | |
| 硼酸盐缓冲液 | Merck | 89273 | |
| 溶剂 | 乙酸 | Merck | 695092 |
| 甲酸 | Merck | 1.93015 | |
| 二甲基亚砜 | MP Biomedicals | 02194819-CF | |
| 质谱分析 | Q-Exactive Plus Biopharma高分辨Orbitrap质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Easy n-LC 1200纳米液相色谱系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Acclaim PepMap RSLC C18色谱柱 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Acclaim PepMap 100预柱 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 蛋白定量 | NanoDrop微量分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本收集和储存 | 收集时间（产后立即），储存温度（-20°C长期，运输用冰盒），避免4-5天后收集初乳 阅读提示：Before you begin, 步骤1-3 |
| 样本分级 | 离心参数（7,500×g，4°C，30分钟），透析条件（3 kDa MWCO，4°C，换水频率），酸沉淀pH（pH 4.6） 阅读提示：Fractionation of samples, 步骤2-17 |
| 体外消化 | 酶浓度（4%胃蛋白酶，4%胰酶），孵育时间（4小时），离心条件（10,000×g，室温，45分钟），超滤（8,000×g，30分钟，4°C） 阅读提示：In vitro gastrointestinal digestion simulation, 步骤20-24 |
| 质谱分析 | 色谱柱（Acclaim PepMap RSLC C18），流动相，梯度（2-80% B，60分钟，300 nL/min），MS/MS设置（正离子模式，m/z 200-2000，CID），数据库（UniProt） 阅读提示：Detection and identification using orbitrap nano-LC-ESI-MS/MS, 步骤27-31 |
| 系统生物学分析 | 工具版本（OmicsBox 2.2.4，STRING 12.0，YLoc，ProtParam），阈值（STRING 0.7），数据库（UniProt，NCBI） 阅读提示：System biology-based protein and peptide profiling, 步骤32-42 |