临床样本分析P. micra丰度
探究P. micra在OSCC组织中的富集及其与临床特征的相关性。
利用公开微生物组数据、RNA测序数据及组织芯片FISH染色，分析P. micra在OSCC、癌旁和正常组织中的丰度，并统计其与分期、转移及EMT标志物的相关性。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
微小单胞菌通过TmpC-CKAP4轴促进口腔鳞状细胞癌转移
Parvimonas micra promotes oral squamous cell carcinoma metastasis through TmpC-CKAP4 axis.
实验完整度
高结合临床样本分析、体外细胞实验、体内小鼠模型、单细胞测序和机制验证，明确功能验证与机制研究。
主要模型
CAL27细胞系 SCC15细胞系 BALB/c裸鼠舌原位异种移植瘤模型 OSCC患者组织样本
重点核对
P. micra的感染复数（MOI）和共培养时间 TmpC重组蛋白的浓度（0.05/0.1 mg/mL）和处理时间 siRNA和shRNA敲低CKAP4的效率验证 体内实验中P. micra的接种量和给药方案 统计方法（ANOVA、t检验等）和重复数
摘要
微小单胞菌（P. micra）是一种口腔机会性病原体，经常存在于口腔病变和感染中。本文报道，P. micra通过TmpC蛋白与CKAP4受体结合，调节HIF-1α诱导的糖酵解和自噬，从而促进口腔鳞状细胞癌的转移。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 口腔机会性病原体P. micra是否促进口腔鳞状细胞癌（OSCC）转移，其分子机制是什么？
- 核心机制
- P. micra表面蛋白TmpC与OSCC细胞受体CKAP4结合，通过CKAP4-RanBP2通路促进HIF-1α的SUMO化稳定，进而诱导糖酵解；同时通过CKAP4-NBR1通路促进自噬，共同驱动肿瘤转移。
- 主要证据
- 临床样本中P. micra富集与转移相关；细胞实验显示P. micra促进迁移侵袭；小鼠舌原位模型证实P. micra促进淋巴结转移；机制实验证实TmpC-CKAP4相互作用及下游信号通路。
- 研究意义
- 本研究首次揭示P. micra通过TmpC-CKAP4轴促进OSCC转移，并证明靶向CKAP4（如masitinib或抗体）可抑制该效应，为OSCC治疗提供潜在靶点和策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外实验评估P. micra对OSCC细胞功能的影响
检测P. micra是否影响OSCC细胞的增殖、迁移和侵袭，并观察EMT标志物的变化。
将CAL27和SCC15细胞与不同MOI的P. micra共培养，进行伤口愈合实验、Transwell迁移和侵袭实验，以及Western blot和qPCR检测EMT标志物。
体内实验验证P. micra促进OSCC转移
验证P. micra在体内是否促进OSCC肿瘤生长和淋巴结转移。
将Luc-CAL27细胞（±P. micra感染）植入免疫缺陷小鼠舌左侧，3周后分析肿瘤体积、淋巴结体积及转移面积，并通过免疫荧光和Western blot检测EMT标志物。
单细胞RNA测序分析肿瘤微环境变化
探究P. micra对肿瘤细胞和肿瘤微环境细胞类型及信号通路的影响。
对原位肿瘤进行scRNA-seq，通过NMF聚类、GSVA和CellChat分析比较P. micra处理组和对照组的差异。
RNA-seq鉴定P. micra激活的信号通路
确定P. micra感染后肿瘤细胞中异常表达的基因和通路。
对CAL27细胞（±P. micra）进行RNA-seq，进行KEGG、GSVA和GSEA分析，发现HIF-1、糖酵解等通路富集。
验证HIF-1α、糖酵解和自噬的激活及其相互调控
确认P. micra是否通过HIF-1α诱导糖酵解和自噬，并明确其上下游关系。
通过Western blot、qPCR、免疫荧光、TEM、自噬通量检测等方法，检测HIF-1α、糖酵解蛋白和自噬标志物，并使用siRNA、抑制剂（DMOG、2-DG、CHQ等）验证因果关系。
鉴定P. micra效应蛋白TmpC及其受体CKAP4
寻找P. micra介导肿瘤促进作用的表面蛋白及其宿主受体。
通过His-pull-down和质谱鉴定TmpC的受体，用Co-IP、SPR、分子对接验证TmpC与CKAP4结合，并通过基因敲除菌株（ΔtmpC）和敲低CKAP4实验验证功能。
机制解析：TmpC-CKAP4下游信号通路
阐明TmpC-CKAP4如何调控HIF-1α稳定性和自噬。
通过免疫共沉淀和质谱分析寻找与CKAP4互作的蛋白（RanBP2和NBR1），并使用siRNA、抑制剂TAK981等验证其参与HIF-1α稳定和自噬诱导。
体内外验证靶向CKAP4的治疗效果
评估阻断CKAP4是否能够抑制P. micra促肿瘤转移作用。
使用小分子masitinib或CKAP4抗体处理细胞或动物模型，检测细菌附着、侵袭、肿瘤生长和转移情况，并分析相关蛋白表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
验证免疫效应
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Shanghai BasalMedia Technologies | -- |
| DMEM/F-12培养基 | Shanghai BasalMedia Technologies | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| 细菌培养 | Schaedler厌氧肉汤 | BD Biosciences | -- |
| 动物实验 | 基质胶 | BD | -- |
| D-荧光素 | -- | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 细胞培养 | TRIzol试剂 | CWBIO | -- |
| RT-qPCR | HiFiScript cDNA合成试剂盒 | Vazyme | -- |
| UltraSYBR混合物 | CWBIO | -- | |
| 细菌附着和侵袭 | CFSE | -- | -- |
| 基因沉默 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| Opti-MEM培养基 | Genom | -- | |
| 代谢检测 | L-乳酸检测试剂盒 | Elabscience | -- |
| 葡萄糖摄取比色法试剂盒 | Elabscience | -- | |
| 蛋白纯化 | His标签蛋白纯化试剂盒 | Byotime | -- |
| GST标签蛋白纯化试剂盒 | -- | -- | |
| Amicon Ultra-15离心过滤器 | Millipore | -- | |
| 分子生物学 | 蛋白酶K | -- | -- |
| His pull-down | Pierce pull-down多组氨酸蛋白相互作用试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 免疫沉淀 | 蛋白A/G琼脂糖珠 | Santa Cruz Biotechnology | -- |
| 免疫共沉淀 | NP-40裂解液 | Beyotime | P0013F |
| SPR分析 | Biacore T200表面等离子体共振仪 | GE Healthcare | -- |
| Western blot | PVDF膜 | Millipore | -- |
| SDS-PAGE凝胶 | EpiZyme | -- | |
| 抗CKAP4抗体 | Proteintech | 16686-1-AP | |
| 抗NBR1抗体 | Santa Cruz | sc-130380 | |
| 抗RanBP2抗体 | Santa Cruz | sc-74518 | |
| 免疫共沉淀 | 抗P62抗体 | Proteintech | 18420-1-AP |
| Western blot | LC3B抗体 | Cell Signaling Technology | -- |
| FISH | FITC标记的P. micra探针 | -- | -- |
| 组织芯片 | 人OSCC组织芯片（HN054Oc01） | Zhongke Guanghua Intelligent Biotechnology Co., Ltd. | -- |
| 细胞培养 | 嘌呤霉素 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细菌培养 | P. micra菌株（ATCC33270）培养条件：厌氧环境（80% N2, 10% CO2, 10% H2）、温度37°C、培养时间3-4天 阅读提示：Methods-Bacteria |
| 细胞培养 | CAL27细胞用DMEM，SCC15用DMEM/F-12，添加10%FBS和1%青霉素-链霉素 阅读提示：Methods-Cell lines |
| 体外感染 | P. micra感染复数（MOI）通常为100，共培养时间（如24小时） 阅读提示：Figure legends（图2） |
| 动物模型 | BALB/c裸鼠（雄性，5-6周龄）植入5×10^6 Luc-CAL27细胞，P. micra MOI=1，3周后分析 阅读提示：Methods-Mouse models |
| 药物处理 | masitinib剂量30 mg/kg，腹腔注射，每日；CKAP4抗体50 μg，每周两次 阅读提示：Methods-Mouse models |
| 基因敲低 | siRNA序列需验证敲低效率；shCKAP4慢病毒构建及嘌呤霉素筛选 阅读提示：Methods-Rescue experiments和补充表5 |