玫菊口服液在小鼠和斑马鱼模型中抗疲劳作用及潜在机制的初步研究

Preliminary investigation of anti-fatigue effects and potential mechanisms of meiju oral liquid in mouse and zebrafish models.

作者信息Lanlan Zhang, Jingcheng Zhao, Xi Zhou, Maitinuer Maiwulanjiang
PMID40048455
期刊PLoS One
发布时间2025-03-06
DOI10.1371/journal.pone.0316761

实验完整度

研究包含小鼠负重游泳实验、斑马鱼模型行为与存活实验、Western blot蛋白验证、RT-qPCR基因表达分析以及UPLC-Q-TOF/MS成分鉴定等多个独立证据层级,完成功能与机制验证。

主要模型

KM小鼠运动疲劳模型 AB品系幼年斑马鱼疲劳模型

重点核对

MOL灌胃剂量:1.67、3.34、6.68 mL/kg,每日一次,连续14天 负重游泳实验:负重7%体重,水温30±2°C,终点为头部沉水超过6秒 斑马鱼亚硫酸钠浓度:8 mg/mL,处理1小时 斑马鱼MOL浓度:5、10、20 μL/mL,处理24小时 Western blot检测肝脏NOX4、TNF-α、p-PI3K、p-AKT蛋白

摘要

玫菊口服液(MOL)是一种具有代表性的中药制剂,源于传统使用的具有抗疲劳特性的特定中草药,包括玫瑰、红枣、菊苣和枸杞。虽然这些单味草药已被公认具有益处,但MOL本身尚未得到广泛研究。本研究旨在评估由这些天然草药制备的MOL的潜在抗疲劳作用,并探讨其潜在机制。本研究采用小鼠和斑马鱼模型来研究MOL的抗疲劳作用。通过超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF/MS)对MOL进行化学表征并鉴定血清中的生物活性化合物。结果表明,MOL显著延长了小鼠负重游泳时间,增加了肝糖原和肌糖原含量,并降低了血清中尿素氮、血乳酸和炎症标志物(IL-1β、IL-6、TNF-α和NO)的水平。此外,MOL下调了疲劳小鼠肝脏中NOX4和TNF-α蛋白的表达,同时上调了p-PI3K和p-AKT蛋白的表达。在斑马鱼模型中,MOL对亚硫酸钠诱导的致死具有保护作用,增强了高速运动轨迹,并增加了正常和疲劳斑马鱼的运动距离。此外,MOL下调了疲劳斑马鱼中IL-1β、IL-6、TNF-α和TNF-β的mRNA水平,同时上调了PI3K和AKT1的mRNA水平。这些发现提示MOL的抗疲劳作用可能通过激活PI3K/AKT信号通路以及抑制TNF-α和NOX4的表达来介导。此外,在MOL中共鉴定出94种化学成分,在小鼠血清中检测到23种迁移化合物。这些迁移化合物可能是主要的活性成分,有助于减少代谢物积累、增强糖原合成和抑制炎症反应。综上所述,我们的研究结果强调了MOL的抗疲劳潜力,值得进一步研究其治疗应用和生物活性化合物的具体作用。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
MOL是否具有抗疲劳作用,其潜在机制是什么?
核心机制
MOL可能通过激活PI3K/AKT信号通路、抑制TNF-α和NOX4表达来发挥抗疲劳作用。
主要证据
在小鼠模型中,MOL显著延长负重游泳时间,增加肝糖原和肌糖原含量,降低BUN、乳酸和炎症因子水平,Western blot显示p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT升高,NOX4和TNF-α降低;在斑马鱼模型中,MOL提高存活率、运动距离,并下调炎症因子mRNA、上调PI3K和AKT1 mRNA。
研究意义
研究为MOL作为抗疲劳候选药物提供了实验依据,并提示其活性成分值得进一步研究。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

小鼠疲劳模型建立与MOL给药

评估MOL对小鼠疲劳模型的影响

将KM小鼠随机分为对照组、模型组和MOL低、中、高剂量组,每日给予相应剂量的MOL或水,连续14天,通过负重游泳实验诱导疲劳。

2

小鼠血清生化与炎症指标检测

评估MOL对疲劳相关代谢产物和炎症因子的影响

游泳实验结束后采集血液,离心分离血清,用ELISA试剂盒检测IL-1β、IL-6、TNF-α和NO水平,同时测定肝糖原、肌糖原、血乳酸和尿素氮。

3

小鼠肝脏蛋白表达分析

明确MOL对PI3K/AKT通路和氧化应激相关蛋白的影响

取小鼠肝脏组织,提取蛋白,通过Western blot检测NOX4、TNF-α、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT和GAPDH的表达。

4

斑马鱼疲劳模型建立与MOL处理

评估MOL对斑马鱼疲劳模型的保护作用

5 dpf幼年斑马鱼用MOL或ROL处理24小时,然后用8 mg/mL亚硫酸钠诱导疲劳,观察存活率和运动行为。

5

斑马鱼基因表达分析

明确MOL对斑马鱼炎症和PI3K/AKT通路基因表达的影响

收集斑马鱼样本,提取RNA,通过RT-qPCR检测TNF-α、TNF-β、IL-1β、IL-6、PI3K和AKT1的mRNA表达。

6

MOL化学成分与血清迁移成分分析

鉴定MOL的化学成分和潜在活性成分

采用UPLC-Q-TOF/MS分析MOL的化学成分,并检测小鼠灌胃后血清中的迁移成分。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
尿素氮含量检测试剂盒Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.BC1535
乳酸含量检测试剂盒Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.BC2235
NO含量检测试剂盒Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.BC1475
肝糖原检测试剂盒Nanjing Jiancheng Bioengineering Research Institute20200513
肌糖原检测试剂盒Nanjing Jiancheng Bioengineering Research Institute20200316
小鼠IL-1β ELISA试剂盒Elabscience Biotechnology Co., LtdE-EL-M0037
小鼠IL-6 ELISA试剂盒Elabscience Biotechnology Co., LtdE-EL-M0044
小鼠TNF-α ELISA试剂盒Elabscience Biotechnology Co., LtdE-EL-M3063
NOX4抗体Abcamab112414
TNF-α抗体Abcamab6671
PI3K抗体Abcamab302958
磷酸化PI3K抗体Abcamab278545
AKT抗体CST9272
磷酸化AKT抗体CST4058
GAPDH抗体ZSGB-BioTA-08
氯化钠Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.7647-14-5
氯化钙Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.10043-52-4
硫酸镁Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.7487-88-9
亚硫酸钠Sigma-Aldrich239321
ZTC1+1-III澄清剂----
RIPA裂解液Beyotime BiotechnologyP0013B
BCA蛋白定量试剂盒Beyotime BiotechnologyP0012
SPARKeasy组织/细胞RNA快速提取试剂盒SparkJadeAC0201
NovoStart SYBR qPCR SuperMix PlusNovoproteinE096
HiScript III RT SuperMix for qPCRVazymeR323
异氟烷----
红景天口服液Hangzhou Huawei Pharmaceutical Co., Ltd.B20050055

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
小鼠分组与给药
动物品系、性别、体重范围、样本量、给药剂量和周期
阅读提示:Materials and methods: Evaluation of anti-fatigue effects ... 中的Experimental grouping and model construction,Table 2
负重游泳实验
负重重量(7%体重)、水温(30±2°C)、水深(约25cm)、终点定义(头部沉水超过6秒)
阅读提示:Materials and methods: Evaluation of anti-fatigue effects ... 中的Experimental grouping and model construction
血清生化与炎症指标检测
采血时间(游泳后30分钟)、血清分离条件(2500rpm 10min 4°C)、检测试剂盒品牌及货号
阅读提示:Materials and methods: Measurement of plasma inflammatory factors by ELISA
Western blot
组织裂解条件、抗体稀释度、内参蛋白、检测蛋白
阅读提示:Materials and methods: Western blot analysis
斑马鱼给药与疲劳诱导
斑马鱼品系、日龄(5 dpf)、培养条件、MOL/ROL浓度、亚硫酸钠浓度及处理时间
阅读提示:Materials and methods: Zebrafish embryo acquisition, Determination of LD50, Effect of MOL on survival rate
RT-qPCR
引物序列、内参基因(β-actin)、PCR反应条件
阅读提示:Materials and methods: Effect of MOL on mRNA expression levels ... 和Table 3