患者遗传诊断
鉴定患者NDUFB7基因的致病突变
对患者血液样本进行全外显子组测序,并通过Sanger测序验证,发现两个复合杂合突变。
NDUFB7 mutations cause brain neuronal defects, lactic acidosis, and mitochondrial dysfunction in humans and zebrafish.
包含患者临床与基因分析、成纤维细胞复合物及超复合物BN-PAGE验证、斑马鱼敲低模型的功能和代谢验证,以及药物挽救实验,证据层级和功能验证充分。
患者皮肤成纤维细胞 斑马鱼胚胎(野生型AB) Tg(Huc:kaede)转基因斑马鱼胚胎
患者携带NDUFB7复合杂合突变(c.133_135del和c.311G>C) 斑马鱼胚胎注射5 ng Ndufb7 tMO(1-cell阶段) 共注射5 pg Ndufb7 mRNA或20 µM MitoQ用于挽救实验 测量24或48 hpf的脑室面积、神经元体积、乳酸含量和耗氧率
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
鉴定患者NDUFB7基因的致病突变
对患者血液样本进行全外显子组测序,并通过Sanger测序验证,发现两个复合杂合突变。
评估NDUFB7突变对线粒体呼吸链复合物活性及组装的影响
培养患者皮肤成纤维细胞,检测电子传递链复合物活性,并通过BN-PAGE分析复合物及超复合物的形成。
在体内探索Ndufb7缺失的功能影响
在1-cell期斑马鱼胚胎中显微注射针对ndufb7的翻译阻断型吗啉代寡核苷酸(tMO),并培养至特定时间点。
评估Ndufb7敲低对脑发育的影响
观察脑室大小(通过图像分析或罗丹明葡聚糖注射),并使用Tg(Huc:kaede)转基因胚胎测量神经元体积。
评估Ndufb7敲低对乳酸水平和线粒体呼吸的影响
测量斑马鱼胚胎的乳酸含量和耗氧率(OCR)。
验证表型特异性并测试潜在治疗药物
共注射ndufb7 mRNA或MitoQ,观察对脑室、神经元、乳酸和OCR表型的挽救效果。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 全外显子组测序 | 安捷伦SureSelectXT人类全外显子50 Mb试剂盒 | Agilent Technologies | version |
| HiSeq 2000TM测序仪 | Illumina | -- | |
| 脑MRI | 1.5-T Sonata MRI系统 | Siemens Healthineer | -- |
| 蓝白电泳 | 抗NDUFA9抗体 | Invitrogen | 459100 |
| 抗70 kDa Fp亚基抗体 | Invitrogen | 459200 | |
| 抗核心亚基1抗体 | Invitrogen | 459140 | |
| 抗亚基I抗体 | Invitrogen | 459600 | |
| 抗NDUFS3抗体 | Abnova | H00004722-A01 | |
| 抗NDUFB10抗体 | Abnova | H00004716-A01 | |
| 抗NDUFV1抗体 | Proteintech | 11238-1-AP | |
| 斑马鱼显微注射 | ndufb7吗啉代寡核苷酸 | Gene Tools | -- |
| HiYieldTM质粒小量提取试剂盒 | Arrowtech | AHP-300 | |
| mMESSAGE mMACHINETM SP6试剂盒 | Invitrogen | AM1340 | |
| 酚红溶液 | Sigma Aldrich | P0290 | |
| 甲磺酸米托醌 | MedChemExpress | HY-100116A | |
| 斑马鱼脑室观察 | 罗丹明B葡聚糖 | Invitrogen | D1824 |
| 斑马鱼神经元成像 | LSM 780激光共聚焦扫描显微镜 | Carl Zeiss | -- |
| 乳酸测量 | Pierce™ BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Scientific | 23225 |
| L-乳酸比色测定试剂盒 | Elabscience | E-BC-K044-S | |
| 耗氧率测量 | Seahorse XFe24细胞外流量分析仪 | Agilent | -- |
| Seahorse XFe24胰岛捕获流动包 | Agilent | 103518-100 | |
| 寡霉素 | MedChemExpress | HY-N26782 | |
| 鱼藤酮 | Sigma Aldrich | R8875 | |
| 斑马鱼养殖 | Danieau缓冲液 | -- | -- |
| 亚甲基蓝 | Hsin Kung Pharmaceutical MFG | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 斑马鱼显微注射 | 注射剂量:5 ng Ndufb7 tMO,共注射5 pg Ndufb7 RNA或20 µM MitoQ 阅读提示:材料与方法中的“Microinjection”小节 |
| 斑马鱼培养与处理 | 胚胎培养在Danieau's buffer中,28.5°C,光照周期14h/10h,用PTU脱色 阅读提示:材料与方法中的“Zebrafish”和“Measurement of brain ventricle area”部分 |
| 脑室大小测量 | 使用Image J测量中脑和后脑脑室面积(像素) 阅读提示:图3图例及“Measurement of brain ventricle area”方法 |
| 神经元体积测量 | 使用Tg(Huc:kaede)转基因胚胎,共聚焦扫描,用MetaMorph软件分析中脑和后脑神经元体积 阅读提示:图5图例及“Measurement of neuronal volume”方法 |
| 乳酸测量 | 收集80-100个胚胎,匀浆后测量乳酸含量,蛋白浓度用BCA法测定 阅读提示:图6图例及“Measurement of lactic acid”方法 |
| 耗氧率测量 | Seahorse XFe24,每孔一个胚胎,加入oligomycin (18.7 µM), FCCP (8 µM), rotenone/antimycin A (3.5 µM)的顺序 阅读提示:图7图例及“Seahorse XFe24 cell Mito stress assay”方法 |