circHSPA8的表达和环状结构验证
明确circHSPA8在乳腺癌组织和细胞中的表达水平，并验证其环状结构。
通过circRNA微阵列分析13例乳腺癌组织和8例癌旁正常组织；qRT-PCR检测153例乳腺癌组织和癌旁组织中circHSPA8表达；Sanger测序验证环化位点；RNase R消化和放线菌素D处理评估稳定性。
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环状RNA circHSPA8通过竞争性抑制miR-195-5p上调WNT3A表达促进乳腺癌转移
Circular RNA circHSPA8 Aggravates Metastasis by Acting as a Competitive Inhibitor of miR-195-5p to Upregulate WNT3A Expression in Breast Cancer.
实验完整度
高包含临床样本分析、体外细胞功能实验、双荧光素酶报告实验、动物体内转移模型等多个独立实验层级，并进行了功能验证和机制验证。
主要模型
MCF-7乳腺癌细胞系 MDA-MB-231乳腺癌细胞系 NOD-SCID小鼠肺转移模型 153例乳腺癌患者临床样本
重点核对
circHSPA8在乳腺癌组织和细胞系中的表达水平（qRT-PCR） circHSPA8过表达和敲低对MCF-7和MDA-MB-231细胞增殖、迁移、侵袭的影响 circHSPA8与miR-195-5p的直接结合（双荧光素酶报告实验） miR-195-5p与WNT3A 3'UTR的直接结合（双荧光素酶报告实验） circHSPA8对体内肺转移灶形成的影响（尾静脉注射NOD-SCID小鼠模型）
摘要
环状RNA（circRNA）通过调控多种生物学行为在肿瘤的发生和进展中发挥重要作用。它作为microRNA海绵，干扰转录和癌基因的异常表达。Hsa_circ_0024715是一种由HSPA8基因特定位点环化产生的circRNA，基于非编码RNA高通量测序发现其在乳腺癌（BC）组织中高表达。然而，其功能仍知之甚少。在本研究中，我们通过qPCR评估了circHSPA8在乳腺癌组织中的表达。前瞻性队列中的生存分析显示，circHSPA8的高表达与不良预后和淋巴结转移相关。在MCF-7细胞中过表达circHSPA8显著增强了其增殖和侵袭能力，而在MDA-MB-231细胞中敲低circHSPA8显著降低了其增殖和侵袭能力。我们发现circHSPA8可以促进乳腺癌细胞的上皮-间质转化（EMT），主要是通过上调WNT3A的表达。这一过程依赖于对miR-195-5p的海绵吸附和抑制，miR-195-5p抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭和转移。体内实验进一步证实，circHSPA8可以促进乳腺癌细胞的血管内渗和外渗以及肺部转移灶的形成。总之，这些数据表明circHSPA8通过作为miR-195-5p的竞争性抑制剂上调WNT3A的表达来促进EMT，提示circRNA在乳腺癌中的失调可能是一个病理因素和潜在的治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- circHSPA8在乳腺癌中的表达及其在肿瘤进展和转移中的作用机制尚不清楚。
- 核心机制
- circHSPA8作为miR-195-5p的海绵，竞争性抑制miR-195-5p，从而解除其对WNT3A的抑制作用，上调WNT3A表达，进而促进乳腺癌细胞的上皮-间质转化（EMT）和转移。
- 主要证据
- 临床样本分析显示circHSPA8高表达与不良预后和淋巴结转移相关；体外实验表明circHSPA8过表达增强MCF-7细胞增殖、迁移和侵袭，敲低则抑制MDA-MB-231细胞；双荧光素酶报告实验证实circHSPA8与miR-195-5p、miR-195-5p与WNT3A 3'UTR的直接结合；体内实验证实circHSPA8促进乳腺癌细胞肺转移。
- 研究意义
- circHSPA8的发现为理解HSPA8在癌症生物学中的功能提供了新的视角，提示circRNA在乳腺癌中的失调可能是一个病理因素和潜在的治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
circHSPA8对乳腺癌细胞体外功能的影响
评估circHSPA8对乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡和细胞周期的影响。
在MCF-7细胞中过表达circHSPA8，在MDA-MB-231细胞中敲低circHSPA8，通过CCK8、克隆形成、Transwell、划痕实验、流式细胞术检测细胞功能。
circHSPA8与miR-195-5p的相互作用验证
验证circHSPA8是否作为miR-195-5p的海绵并直接结合。
利用生物素标记的circHSPA8探针进行RNA pull-down，qRT-PCR检测候选miRNA；双荧光素酶报告实验验证circHSPA8与miR-195-5p的直接结合。
circHSPA8通过miR-195-5p调控WNT3A表达及对EMT的影响
验证circHSPA8通过miR-195-5p调控WNT3A表达，并影响EMT相关标志物。
在MCF-7和MDA-MB-231细胞中转染miR-195-5p mimics或inhibitors，并联合circHSPA8过表达或敲低，通过Western blot检测WNT3A和EMT相关蛋白表达。
circHSPA8对体内转移能力的影响
评估circHSPA8在体内对乳腺癌细胞外渗和肺转移灶形成的影响。
将CFSE标记的MCF-7和MDA-MB-231细胞（经circHSPA8过表达或敲低处理）通过尾静脉注射NOD-SCID小鼠，在5h和24h后分析肺组织中的荧光信号；4周后通过活体成像和HE染色分析肺转移灶。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| circRNA微阵列分析 | NEBNext Ultra RNA文库制备试剂盒 | New England Biolabs | -- |
| Illumina Hiseq XTEN测序平台 | Illumina | -- | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | invitrogen | -- | |
| 青霉素 | -- | -- | |
| 链霉素 | -- | -- | |
| CCK8实验 | CCK-8溶液 | -- | -- |
| 自动酶标仪 | Tecan | -- | |
| 质粒构建 | PCR Bestaq预混液 | abm | -- |
| GeneJet质粒小提试剂盒 | Thermo Scientific | -- | |
| pHB-circBasic载体 | -- | -- | |
| HB-infusion预混液 | Jikai | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine3000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| 流式细胞术 | PI/RNase A染色液 | KeyGEN BioTECH | -- |
| CytoFLEX SRT流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- | |
| Annexin V-FITC试剂 | Elabscience | -- | |
| PI试剂 | Elabscience | -- | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| RNA处理 | RNase R | Epicentre | -- |
| Western blot | WNT3A抗体 | Abcam | ab172612 |
| E-cadherin抗体 | CST | 3195 | |
| N-cadherin抗体 | CST | 13116 | |
| Snail抗体 | CST | 3879 | |
| Vimentin抗体 | CST | 5741 | |
| GAPDH抗体 | Proteintech Group Inc. | 60004-1-Ig | |
| BCA蛋白定量 | Biosharp | -- | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| 牛血清白蛋白 | Thermo Fisher | -- | |
| HRP标记二抗 | Thermo Fisher | -- | |
| 增强化学发光检测试剂 | Thermo Fisher | -- | |
| 克隆形成实验 | 结晶紫 | -- | -- |
| Transwell实验 | HTS transwell-24系统 | Corning | -- |
| 基质胶 | -- | -- | |
| 双荧光素酶报告实验 | pMIR-REPORT质粒 | Thermo Scientific | AM5795 |
| 双荧光素酶报告系统试剂盒 | Promega | E1910 | |
| 动物实验 | CFSE | -- | -- |
| NOD SCID小鼠 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床样本分析 | 153例乳腺癌患者的肿瘤组织和癌旁组织；分期和淋巴结转移状态；circHSPA8表达水平（qRT-PCR）与生存分析的关联。 阅读提示：Methods 2.1 Tissue Samples；Results 3.1 和图1C, K-M |
| 细胞培养 | MCF-7和MDA-MB-231细胞系来源；DMEM培养基含10% FBS和1%双抗；培养条件37°C, 5% CO2。 阅读提示：Methods 2.3 Cell Culture |
| 体外功能实验 | circHSPA8过表达质粒和敲低载体构建；转染条件（Lipofectamine3000）；细胞密度（CCK8 2000 cells/well；克隆形成500 cells/well；Transwell 5×10^4 cells/100 μL）；处理时间（24h、48h、72h等）。 阅读提示：Methods 2.4-2.11；Results 3.2 和图2 |
| miRNA结合验证 | 双荧光素酶报告实验的质粒构建（野生型和突变型circHSPA8和WNT3A 3'UTR）；共转染miR-195-5p mimics/inhibitors；检测荧光素酶活性。 阅读提示：Methods 2.5, 2.12；Results 3.3, 3.5 和图3D-F, 5B-C |
| 动物实验 | NOD-SCID小鼠品系和数量；细胞注射数量（MCF-7 2×10^6 cells/mouse，MDA-MB-231 1×10^6 cells/mouse）和途径（尾静脉）；观察时间点（5h、24h、4周）；麻醉和处死方法。 阅读提示：Methods 2.13, 2.14；Results 3.6 和图7 |