细胞培养与转导
建立稳定表达His10-UFM1ΔSC的细胞系。
将His10-UFM1ΔSC基因插入慢病毒载体，转导细胞后通过FACS筛选阳性细胞。
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核UFM化蛋白的纯化与分析方案
Protocol for the purification and analysis of nuclear UFMylated proteins.
实验完整度
高包含细胞分级分离、亲和纯化、质谱鉴定和免疫印迹验证等多个独立实验层级。
主要模型
hTERT-RPE1细胞 HEK293细胞 U2OS细胞 HCT116细胞
重点核对
细胞系：hTERT-RPE1、HEK293、U2OS、HCT116 His10-UFM1ΔSC表达：慢病毒转导及FACS分选 核提取物量：500 μg至2.5 mg Ni-NTA磁珠量：10-50 μL 质谱分析：每个样本至少三次重复注射
摘要
蛋白质UFM化调控多种细胞过程，包括核糖体质量控制与核DNA修复。在此，我们提出一种技术，用于从常用哺乳动物细胞系模型（如hTERT-RPE1、HEK293、U2OS和HCT116细胞）中，在变性非还原条件下分离细胞核并纯化UFM化蛋白。随后，我们描述了利用质谱和免疫印迹鉴定和分析纯化UFM化蛋白的程序。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何从哺乳动物细胞中分离并鉴定核UFM化蛋白？
- 核心机制
- 文中未明确说明，但涉及UFM1与底物蛋白的共价结合。
- 主要证据
- 通过亚细胞分级分离和变性亲和纯化，结合质谱和免疫印迹鉴定核UFM化蛋白。
- 研究意义
- 该方案可用于研究核UFM化蛋白在核糖体质量控制与核DNA修复等过程中的作用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细胞分级分离
分离细胞核与细胞质部分。
收获细胞，用低渗裂解缓冲液裂解，离心沉淀细胞核，保留细胞质上清。
核提取物制备
在变性条件下提取核蛋白。
用含8M尿素的裂解缓冲液裂解细胞核，超声处理并离心澄清。
亲和纯化
纯化His10-UFM1ΔSC偶联蛋白。
将核提取物与Ni-NTA磁珠孵育，洗涤后洗脱或用于质谱分析。
SDS-PAGE与免疫印迹
验证细胞分级和纯化效率。
对胞质和核级分以及亲和纯化蛋白进行SDS-PAGE和免疫印迹分析。
质谱分析
鉴定纯化的核UFM化蛋白。
对纯化蛋白进行胰蛋白酶消化、脱盐、液相色谱分离和质谱鉴定。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | HisPur Ni-NTA磁珠 | Thermo Fisher Scientific | 88831 |
| 细胞裂解 | cOmplete无EDTA蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma | 11873580001 |
| Benzonase核酸酶 | Sigma | E1014 | |
| SDS-PAGE | NuPAGE Bis-Tris 4%-12%凝胶 | Invitrogen | NP0326BOX |
| 质谱 | C18 ZipTips | MilliporeSigma | ZTC18S096 |
| C18 Pico-Frit反相色谱柱 | Phenomenex | -- | |
| Easy-nLC II系统 | Proxeon Biosystems | -- | |
| Orbitrap Fusion Tribrid质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与转导 | 细胞类型、转导细胞数量、质粒载体 阅读提示：Step 1: 细胞培养，Step 2: 转导，见正文 |
| 细胞分级分离 | 低渗裂解缓冲液组成、离心速度和时间、Triton X-100浓度 阅读提示：Step 1: 细胞分级分离，见图1 |
| 核提取物制备 | 尿素浓度、超声参数、离心速度和时间 阅读提示：Step 2: 核提取物制备，见图2 |
| 亲和纯化 | 核提取物量、磁珠体积、孵育时间、洗涤次数和缓冲液 阅读提示：Step 3-4: 亲和纯化，见图2 |
| SDS-PAGE与免疫印迹 | 上样量、抗体稀释度、转膜条件 阅读提示：Step 7-10，见图3和图4 |
| 质谱分析 | 色谱柱、流动相梯度、质谱参数、数据过滤阈值 阅读提示：Step 11-14，见质谱分析部分 |