重组HBcAg和preS1的表达与纯化
获得用于免疫和检测的HBcAg和preS1蛋白
将HBcAg（Aa1-149）和preS1（Aa1-119）基因构建到pET25b载体，在BL21(DE3)中表达，通过离心和透析纯化HBcAg颗粒，preS1用Ni-NTA纯化。
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一种细胞穿透性双特异性抗体抑制乙型肝炎病毒的复制和分泌
A cell-penetrating bispecific antibody suppresses hepatitis B virus replication and secretion.
实验完整度
高包含多个独立证据层级：体外HBV稳定细胞系HepG2.2.15、HBV感染模型HepG2-NTCP，以及功能验证和机制探讨。
主要模型
HepG2.2.15细胞 HepG2-NTCP细胞感染模型 HepAD38细胞（病毒生产）
重点核对
抗体的细胞穿透效率（免疫荧光染色，使用10 μg/mL抗体处理12小时） 抗体的细胞特异性（比较HepG2.2.15与HepG2细胞） 治疗剂量（2.5, 5, 10, 20, 40 μg/mL） 治疗时间点（12, 24, 36, 48小时） HBV感染模型中的抗体浓度（50 μg/mL）及检测时间（2, 4, 6, 8天）
摘要
乙型肝炎病毒（HBV）是导致慢性肝病和肝细胞癌（HCC）发展的主要病原体之一。目前批准的抗HBV药物不能根除病毒或阻止HCC的发展。HBV核衣壳由乙型肝炎核心抗原（HBcAg）和HBV松弛环状部分双链DNA（rcDNA）组成，在病毒复制中不可或缺。本研究报道了一种靶向HBcAg和preS1的细胞穿透性双特异性抗体，与细胞穿透肽R9TAT融合，命名为Anti-preS1 × Anti-HBcAg-R9TAT。该抗体能识别preS1和HBcAg，并高效内化进入活细胞，在体外抑制细胞外乙型肝炎表面抗原（HBsAg）和乙型肝炎e抗原，以及细胞内HBsAg和HBcAg。这种细胞穿透性双特异性抗体是抑制HBV复制和分泌的新方法，是有前景的抗HBV治疗性抗体候选药物。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何设计一种能够穿透细胞膜并靶向细胞内HBcAg的抗体，以抑制HBV复制和分泌？
- 核心机制
- 该双特异性抗体通过R9TAT融合实现细胞穿透，并通过anti-preS1部分靶向HBV感染的肝细胞，再通过anti-HBcAg部分结合细胞内HBcAg，可能阻断核衣壳组装和pgRNA包装，从而抑制病毒复制和分泌。
- 主要证据
- 在HepG2.2.15细胞和HepG2-NTCP感染模型中，Anti-preS1 × Anti-HBcAg-R9TAT显著降低细胞外HBsAg、HBeAg以及细胞内HBsAg、HBcAg水平，且呈剂量和时间依赖性。
- 研究意义
- 该细胞穿透性双特异性抗体是抑制HBV复制和分泌的新方法，可作为抗HBV治疗性抗体候选药物，具有进一步体内应用的潜力。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
抗体的筛选与生成
获得针对HBcAg和preS1的特异性抗体
用HBcAg免疫羊驼，通过噬菌体展示筛选anti-HBcAg VHH；用preS1免疫小鼠，通过单B细胞技术筛选anti-preS1抗体。
抗体的重组表达与纯化
表达和纯化各种形式的抗体
将抗体基因构建到pcDNA3.1载体，在HEK-293F细胞中表达，通过protein A亲和纯化。
抗体的反应性验证
确认抗体与HBcAg和preS1的特异性结合
使用ELISA检测anti-HBcAg VHH与HBcAg和HBeAg的反应性，anti-preS1 Fc与preS1和HBsAg的反应性，以及双特异性抗体的反应性。
细胞穿透和细胞特异性评估
评估R9TAT融合和双特异性设计对抗体内化和特异性的影响
用四种抗体处理HepG2.2.15和HepG2细胞，进行免疫荧光染色，比较荧光强度。
治疗效果的体外评估（HepG2.2.15）
评估抗体的抗HBV效果
用不同浓度的五种抗体处理HepG2.2.15细胞，检测上清和细胞裂解液中的HBsAg、HBeAg、HBcAg水平。
治疗效果的感染模型验证（HepG2-NTCP）
在HBV感染模型中验证抗体的效果
使用HepAD38产生的HBV感染HepG2-NTCP细胞，同时给予抗体处理，检测上清中HBsAg和HBeAg水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白表达 | pET25b载体 | -- | -- |
| 大肠杆菌BL21(DE3) | AlpaLifeBio, Inc. | KTSM104L | |
| 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 | -- | -- | |
| 蛋白纯化 | 镍-次氮基三乙酸树脂 | Qiagen GmbH | 31014 |
| 抗体表达 | pcDNA3.1载体 | -- | -- |
| 抗体纯化 | 蛋白A树脂 | GenScript | L00210 |
| 细胞培养 | 杜尔贝科改良伊格尔培养基 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 11965092 |
| 胎牛血清 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | A5670701 | |
| 青霉素和链霉素 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 15140122 | |
| Opti-MEM培养基 | Gibco/Invitrogen | -- | |
| William's E培养基 | -- | -- | |
| 二甲基亚砜 | -- | -- | |
| 嘌呤霉素 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 重组蛋白表达 | HEK-293F细胞 | -- | -- |
| 抗体检测 | HRP标记的抗VHH多克隆抗体 | GenScript | A01861 |
| SuperSignal ELISA Pico化学发光底物 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 37070 | |
| 定量检测 | HBsAg/HBeAg ELISA试剂盒 | Elabscience Biotechnology, Inc. | E-EL-H6080 |
| HBeAg ELISA试剂盒（Lianzu Biology） | Lianzu Biology | LZ-E028718 | |
| 免疫荧光 | 抗小鼠IgG-FITC | -- | -- |
| 抗HBcAg兔多克隆抗体 | -- | -- | |
| 抗兔AF647二抗 | -- | -- | |
| 显微镜 | 共聚焦显微镜（ZEISS） | ZEISS | -- |
| 统计分析 | GraphPad Prism 7.0 | Dotmatics | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 重组蛋白表达与纯化 | 大肠杆菌菌株BL21(DE3)（KTSM104L）和Ni-NTA树脂（31014）的使用条件；HBcAg和preS1的诱导条件（IPTG浓度、温度、时间）；纯化步骤（尿素浓度、透析条件、咪唑洗脱浓度）。 阅读提示：Methods 2.1 |
| 抗体筛选与重组表达 | 免疫方案（羊驼免疫次数和间隔，小鼠免疫次数和间隔）；噬菌体展示文库构建和淘选轮数；单B细胞分选和测序方法；抗体表达系统（HEK-293F细胞）和纯化方法（protein A树脂，L00210）。 阅读提示：Methods 2.2 |
| 细胞穿透和特异性实验 | 细胞培养条件（HepG2.2.15和HepG2）和抗体处理浓度（10 μg/mL）及时间（12小时）；免疫荧光染色步骤（一抗、二抗、DAPI）。 阅读提示：Results 3.5, Figure 5 and 6 legends |
| 治疗功效评估（HepG2.2.15） | 抗体浓度（2.5, 5, 10, 20, 40 μg/mL）和处理时间（24小时）；检测指标（细胞外HBsAg/HBeAg、细胞内HBsAg/HBcAg）和ELISA试剂盒（E-EL-H6080）。 阅读提示：Results 3.6, Figure 7 legend |
| HBV感染模型治疗实验 | 病毒生产条件（HepAD38细胞，去除四环素，培养基含2% DMSO）；感染剂量（5×10^7 copies/well）；抗体浓度（50 μg/mL）和检测时间点（2,4,6,8天）；检测试剂盒（E-EL-H6080, LZ-E028718）。 阅读提示：Results 3.7, Methods 2.6, 2.7, Figure 8 legend |