数据收集和差异表达基因识别
合并GEO数据集并去除批次效应,鉴定AD与对照之间的差异表达基因。
从GEO数据库获取GSE52093、GSE147026、GSE153434数据集,使用SVA算法去除批次效应后合并,应用limma包识别DEGs(FDR<0.05, |log2FC|≥1),共得到1131个DEGs。
Establishment of a nomogram model based on immune-related genes using machine learning for aortic dissection diagnosis and immunomodulation assessment.
结合大量生物信息学分析(GEO数据集、WGCNA、机器学习)与体外实验(qRT-PCR、Western blot、ELISA)对基因表达进行验证,但缺乏功能或机制验证。
主动脉组织样本(AD患者与健康对照) 血清样本(AD患者与健康对照)
训练集(GSE52093、GSE147026、GSE153434)共21例AD患者和19例对照,合并后用于识别差异表达基因 外部验证集GSE98770(6例患者、5例对照)和GSE190635(4例患者、4例对照) 用于qRT-PCR和ELISA验证的临床样本:10例健康供体和12例AD患者(2021-2022年)
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
合并GEO数据集并去除批次效应,鉴定AD与对照之间的差异表达基因。
从GEO数据库获取GSE52093、GSE147026、GSE153434数据集,使用SVA算法去除批次效应后合并,应用limma包识别DEGs(FDR<0.05, |log2FC|≥1),共得到1131个DEGs。
识别与免疫评分相关的基因模块。
使用R包WGCNA,选择软阈值β=10(scale-free R²=0.98)构建基因共表达网络,通过动态修剪和TOM聚类将1131个基因分为三个模块,其中绿色模块与免疫和致病性高度相关(相关系数0.86,P=1×10-12),包含136个基因。
探索模块基因的生物学功能,并通过蛋白质-蛋白质相互作用网络筛选枢纽基因。
通过GO和KEGG富集分析揭示模块基因主要涉及炎症反应、细胞因子反应等;使用STRING构建PPI网络,并用Cytoscape及cytoHubba插件的五种拓扑算法(DMNC、MCC、MNC、Degree、EPC)筛选出15个枢纽基因。
从15个枢纽基因中筛选用于诊断的特征基因。
应用LASSO、SVM-RFE和随机森林三种算法筛选特征基因,通过Venn图取交集得到四个关键基因:CXCL1、ITGA5、PTX3、TIMP1。
基于四个特征基因构建诊断评分和列线图模型,并评估其性能。
通过多变量逻辑回归计算回归系数,建立诊断评分公式;构建列线图,并通过校准曲线、决策曲线分析和临床影响曲线评估模型性能。
验证诊断评分在外部数据集中的预测能力。
使用GSE98770和GSE190635数据集作为外部验证,评估模型性能。
分析AD与对照样本中免疫细胞浸润差异,并探索四个特征基因与免疫细胞的相关性。
使用CIBERSORT和ssGSEA算法量化免疫细胞比例,分析差异;并探索四个基因与免疫细胞的相关性。
验证四个基因在AD患者组织和血清中的表达水平。
收集AD患者和健康供体的主动脉组织和血清样本,通过qRT-PCR、Western blot和ELISA检测四个基因的表达。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| RNA提取 | RNeasy Micro 试剂盒 | Qiagen | 74104 |
| cDNA合成 | QuantiTect反转录试剂盒 | Qiagen | 205311 |
| qRT-PCR | SYBR Green qPCR预混液 | Bio-Rad | 1725110 |
| Western blotting | PVDF膜 | Bio-Rad | #1620177 |
| 湿转仪 | Bio-Rad | #1703930 | |
| CXCL1抗体 | Invitrogen | #PA1-29220 | |
| PTX3抗体 | Invitrogen | #PA5-101097 | |
| ITGA5抗体 | Protein tech | #10569-1-AP | |
| TIMP1抗体 | Santa Cruz | #sc-21734 | |
| β-actin抗体 | Santa Cruz | #sc-47778 | |
| Bio-Rad Clarity ECL底物 | Bio-Rad | #1705060 | |
| ChemiDoc XRS+系统 | Bio-Rad | -- | |
| ELISA | CXCL1 ELISA试剂盒 | Elab Sciences | #E-EL-H0045 |
| TIMP1 ELISA试剂盒 | Elab Science | #E-EL-H0184 | |
| ITGA5 ELISA试剂盒 | Boster Bio | #EK2227 | |
| PTX3 ELISA试剂盒 | Invitrogen | #EH386RB | |
| Tecan Spark酶标仪 | -- | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 数据获取与处理 | 数据集GSE52093、GSE147026、GSE153434的样本量和分组;合并后训练集包含21例AD和19例对照;log2转换;SVA算法的应用。 阅读提示:Materials and Methods: Public data collection and de-batching |
| 差异表达基因和WGCNA | DEGs筛选阈值(FDR<0.05, |log2FC|≥1);软阈值β=10;模块识别。 阅读提示:Materials and Methods: Identification of immune-related disease-causing genes; Results: Identification of immune-related disease-causing genes |
| 机器学习 | LASSO参数(family='binomial', nfolds=10);SVM-RFE参数(halfve. above=20, k=10);随机森林参数(ntree=500, mtry=3, importance=T)。 阅读提示:Materials and Methods: Machine learning |
| 模型验证 | 外部验证数据集GSE98770和GSE190635的样本组成;ROC曲线分析及AUC值。 阅读提示:Materials and Methods: External validation; Results: Validation and performance evaluation |
| 患者样本验证 | 样本来源(10例健康供体和12例AD患者);qRT-PCR引物序列;Western blot抗体稀释度;ELISA试剂盒型号。 阅读提示:Materials and Methods: Ethics statement and clinical sample collection, RNA extraction and qRT-PCR, Protein extraction and western blotting, Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) |