雄性性别决定维持蛋白质稳态并延长daf-18/PTEN缺陷秀丽隐杆线虫的寿命

Male sex determination maintains proteostasis and extends lifespan of daf-18/PTEN deficient C. elegans.

作者信息Zhi Qu, Lu Zhang, Xue Yin, Fangzhou Dai, Wei Huang, Yutong Zhang, Dongyang Ran, Shanqing Zheng

PMID39820856

期刊EMBO Rep

发布时间2025-02

DOI10.1038/s44319-025-00368-x

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实验完整度

高

包含L1停滞存活、成虫寿命、RNA-seq、UPRER检测、蛋白聚集、泛素化、蛋白酶体活性、蛋白毒性模型（A-β和α-syn）等多项独立实验，并进行了功能验证（过表达/敲低）及机制验证（磷酸酶突变体和性别决定基因干预）。

主要模型

秀丽隐杆线虫（C. elegans） daf-18(ok480)突变体 CL2006（β-淀粉样蛋白毒性模型） NL5901（α-突触核蛋白毒性模型）

重点核对

daf-18(ok480)雄性成虫寿命显著长于雌雄同体； unc-23在daf-18缺陷雄性中上调，敲低后雄性寿命缩短； DAF-18蛋白磷酸酶活性（D137A）而非脂质磷酸酶活性（G174E）决定生存优势； C18E9.2丝氨酸301磷酸化导致蛋白质毒性； MG132抑制蛋白酶体可消除雄性生存优势

摘要

尽管雌性通常具有生存优势，但PTEN功能异常的雌性患肿瘤的风险高于雄性。然而，每种性别对PTEN功能障碍的反应差异很少被研究。我们使用秀丽隐杆线虫来研究雄性和雌雄同体线虫对PTEN同源物daf-18功能障碍的反应。我们的研究揭示，雄性线虫能够抵消daf-18缺失的负面影响，从而延长成虫寿命。这种生存优势依赖于DAF-18蛋白磷酸酶活性的丧失，而其脂质磷酸酶活性则是可有可无的。DAF-18蛋白磷酸酶活性的缺乏导致内质网膜蛋白C18E9.2/SEC62去磷酸化失败，引起雌雄同体中未折叠和聚集蛋白水平升高。相比之下，雄性通过UNC-23/NEF介导的蛋白质泛素化和降解过程维持蛋白质稳态，从而获得生存优势。我们发现性别决定是调节unc-23在性别间差异表达以响应daf-18缺失的关键因素。这些发现强调了雄性性别决定通路在调节蛋白质降解中的独特作用。

daf-18缺失的性别特异性生存分析

评估daf-18缺失对雄性和雌雄同体线虫生存的影响。

通过L1停滞生存实验和成虫寿命分析，比较daf-18(ok480)雄性和雌雄同体与对照（him-5）的存活率。

转录组分析鉴别差异表达基因

寻找daf-18缺失后雄性特异性上调的生存相关基因。

对daf-18(ok480)雄性和雌雄同体进行RNA-seq，分析差异表达基因，并进行KEGG通路富集和实时PCR验证。

验证unc-23功能

验证unc-23是否介导daf-18缺陷雄性的生存优势。

通过RNAi敲低和过表达实验，观察unc-23对L1停滞存活和成虫寿命的影响。

蛋白稳态与泛素化分析

评估daf-18缺失对未折叠蛋白、蛋白聚集和泛素化的影响。

使用UPRER报告基因（hsp-4p::GFP）、PROTEOSTAT蛋白聚集检测、Western blot检测总泛素化和K48链接泛素化。

蛋白酶体活性检测

验证daf-18缺陷雄性是否通过增强蛋白酶体活性降解未折叠蛋白。

利用荧光底物Z-Gly-Gly-Leu-AMC检测26S蛋白酶体糜蛋白酶样活性，并用MG132抑制验证。

蛋白毒性模型验证

在A-β和α-突触核蛋白毒性模型中验证daf-18缺陷雄性的蛋白稳态优势。

使用CL2006（表达A-β2-42）和NL5901（表达α-synuclein）品系，分析瘫痪率、A-β聚集、α-syn聚集体和运动能力。

DAF-18磷酸酶活性与底物鉴定

鉴定DAF-18蛋白磷酸酶底物并验证其磷酸化状态对蛋白稳态的影响。

通过磷酸化蛋白质组学比较N2和daf-18(D137A)的磷酸化位点，发现C18E9.2S301磷酸化；构建C18E9.2(S301E/S301A)突变体并分析寿命和蛋白稳态。

性别决定通路分析

确定性别决定通路是否调控unc-23表达及daf-18缺陷雄性的生存优势。

通过RNAi和突变体干扰性别决定基因（tra-3、her-1、fem-2等），观察unc-23表达、寿命和蛋白稳态变化。

实验环节	名称	品牌	货号
RNAi	四环素	Sangon Biotech	64-75-5
异丙基-β-D-硫代半乳糖苷	Sigma	15502
RNA提取	RNAiso Plus	Takara	9109
PCR扩增	Phusion高保真PCR预混液	Thermo Scientific	F531L
cDNA合成	高效cDNA逆转录试剂盒	Applied Biosystems	4368814
实时PCR	Power SYBR Green PCR预混液	Applied Biosystems	4368577
DNA纯化	GenElute凝胶回收试剂盒	Sigma	NA1111
DNA连接	快速连接试剂盒	NEB	M2200L
蛋白聚集检测	PROTEOSTAT蛋白聚集检测试剂盒	Enzo Life Sciences	ENZ-51023-KP002
蛋白酶体活性检测	Z-Gly-Gly-Leu-AMC（荧光底物）	Sigma	SCP0225
Western blot	抗泛素单克隆抗体（P4D1）	CST	3936S
K48抗体	Abcam	ab140601
抗β-微管蛋白抗体	Abways	AB0039
山羊抗兔IgG（H+L）（过氧化物酶/HRP偶联）	Elabscience	E-AB-1003
HRP标记的山羊抗小鼠IgG（H+L）	Beyotime	A0216
β-淀粉样蛋白1-16抗体（6E10）	PTM Bio	PTM-20007
显微注射	pJRK248质粒	Addgene	Plasmid #173755
L2528质粒	Addgene	Plasmid #1606
荧光成像	Leica M165 FC荧光体视显微镜	Leica	--

实验环节

名称

品牌

货号

RNAi

四环素

Sangon Biotech

64-75-5

异丙基-β-D-硫代半乳糖苷

Sigma

15502

RNA提取

RNAiso Plus

Takara

9109

PCR扩增

Phusion高保真PCR预混液

Thermo Scientific

F531L

cDNA合成

高效cDNA逆转录试剂盒

Applied Biosystems

4368814

实时PCR

Power SYBR Green PCR预混液

Applied Biosystems

4368577

DNA纯化

GenElute凝胶回收试剂盒

Sigma

NA1111

DNA连接

快速连接试剂盒

NEB

M2200L

蛋白聚集检测

PROTEOSTAT蛋白聚集检测试剂盒

Enzo Life Sciences

ENZ-51023-KP002

蛋白酶体活性检测

Z-Gly-Gly-Leu-AMC（荧光底物）

Sigma

SCP0225

Western blot

抗泛素单克隆抗体（P4D1）

CST

3936S

K48抗体

Abcam

ab140601

抗β-微管蛋白抗体

Abways

AB0039

山羊抗兔IgG（H+L）（过氧化物酶/HRP偶联）

Elabscience

E-AB-1003

HRP标记的山羊抗小鼠IgG（H+L）

Beyotime

A0216

β-淀粉样蛋白1-16抗体（6E10）

PTM Bio

PTM-20007

显微注射

pJRK248质粒

Addgene

Plasmid #173755

L2528质粒

Addgene

Plasmid #1606

荧光成像

Leica M165 FC荧光体视显微镜

Leica

环节	核对要点
L1停滞存活实验	M9中添加0.08%乙醇；每日转移50-100μL含100个以上L1虫液至NGM板，3天后统计存活比例；样本量n≥280（每日）；重复三次阅读提示：见Methods 'Survival and lifespan assays' 及图1A/B图注
成虫寿命分析	同步化L3-L4雄性或雌雄同体随机挑选；每日记录生存；样本量每组n≈77-101；重复三次阅读提示：见Methods 'Survival and lifespan assays' 及图1C-F图注
RNAi处理	使用HT115菌株，含空载体L4440或靶基因RNAi；LB琼脂含氨苄青霉素（100 μg/mL）和四环素（12.5 μg/mL）；NGM-amp（100 μg/mL）加1 mM IPTG诱导；L4幼虫处理24小时阅读提示：见Methods 'RNAi'
实时PCR	使用RNAiso Plus提取RNA；cDNA合成试剂盒；SYBR Green；内参cdc-42；至少3个生物学重复阅读提示：见Methods 'Real-time PCR'
蛋白聚集检测	PROTEOSTAT试剂盒；蛋白浓度1 μg/mL至10 mg/mL；使用96孔板，2μL检测试剂；荧光测定（激发550nm，发射600nm）阅读提示：见Methods 'PROTEOSTAT analysis'
Western blot分析	总蛋白20 μg；SDS-PAGE；PVDF膜；抗泛素（P4D1）1:200；K48抗体1:200；β-tubulin 1:5000 阅读提示：见Methods 'Western blot analysis'
蛋白酶体活性检测	总蛋白25 μg；底物Z-Gly-Gly-Leu-AMC；荧光测定（激发380nm，发射460nm），每5分钟读一次，持续1小时阅读提示：见Methods '26S proteasome fluorogenic peptidase assays'
RNA-seq	年轻成虫；分离雄性和雌雄同体（L3至L4阶段）；RNA质量（浓度约50 ng/μL，总量35 μL）；文库制备使用KAPA Stranded RNA-Seq Kit；参考基因组WBcel235 阅读提示：见Methods 'RNA sequencing'

环节

核对要点

L1停滞存活实验

M9中添加0.08%乙醇；每日转移50-100μL含100个以上L1虫液至NGM板，3天后统计存活比例；样本量n≥280（每日）；重复三次

阅读提示：见Methods 'Survival and lifespan assays' 及图1A/B图注

成虫寿命分析

同步化L3-L4雄性或雌雄同体随机挑选；每日记录生存；样本量每组n≈77-101；重复三次

阅读提示：见Methods 'Survival and lifespan assays' 及图1C-F图注

RNAi处理

使用HT115菌株，含空载体L4440或靶基因RNAi；LB琼脂含氨苄青霉素（100 μg/mL）和四环素（12.5 μg/mL）；NGM-amp（100 μg/mL）加1 mM IPTG诱导；L4幼虫处理24小时

阅读提示：见Methods 'RNAi'

实时PCR

使用RNAiso Plus提取RNA；cDNA合成试剂盒；SYBR Green；内参cdc-42；至少3个生物学重复

阅读提示：见Methods 'Real-time PCR'

蛋白聚集检测

PROTEOSTAT试剂盒；蛋白浓度1 μg/mL至10 mg/mL；使用96孔板，2μL检测试剂；荧光测定（激发550nm，发射600nm）

阅读提示：见Methods 'PROTEOSTAT analysis'

Western blot分析

总蛋白20 μg；SDS-PAGE；PVDF膜；抗泛素（P4D1）1:200；K48抗体1:200；β-tubulin 1:5000

阅读提示：见Methods 'Western blot analysis'

蛋白酶体活性检测

总蛋白25 μg；底物Z-Gly-Gly-Leu-AMC；荧光测定（激发380nm，发射460nm），每5分钟读一次，持续1小时

阅读提示：见Methods '26S proteasome fluorogenic peptidase assays'

RNA-seq

年轻成虫；分离雄性和雌雄同体（L3至L4阶段）；RNA质量（浓度约50 ng/μL，总量35 μL）；文库制备使用KAPA Stranded RNA-Seq Kit；参考基因组WBcel235

阅读提示：见Methods 'RNA sequencing'

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