鉴定Spt5相互作用蛋白
通过蛋白质组学发现与Spt5相关的新因子，鉴定Xrn2。
从野生型和Spt5突变体（T1A、T1E、dis2Δ）中纯化Flag标记的Spt5复合物，并通过质谱分析鉴定相互作用蛋白。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
DSIF因子Spt5协调RNA聚合酶II转录物的转录、成熟和外切核酸降解
DSIF factor Spt5 coordinates transcription, maturation and exoribonucleolysis of RNA polymerase II transcripts.
实验完整度
高包含体外重建、酶活测定、交联质谱、cryo-EM结构、体内TT-seq、ChIP-seq及功能性报告基因等多层级独立证据，并验证了功能与机制。
主要模型
裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe） 体外重建的Pol II-DSIF-Xrn2-Rai1复合物（含DNA/RNA支架） Xrn2 degron菌株（AID标签） Spt5 degron菌株（AID标签）
重点核对
Xrn2活性对Pol II脱离DNA模板的作用（体外终止实验） Spt5通过Kow5-CTR结构域刺激Xrn2外切核酸酶活性 Xrn2通过α螺旋环（残基481-496）与Pol II的Rpb2/Rpc10区域结合 Spt5耗竭对Pol II转录延伸、剪接和3'端加工的影响（TT-seq分析） Xrn2催化失活突变（D237A）导致的转录通读缺陷
摘要
前体信使RNA在RNA聚合酶II转录过程中被加工成其功能形式。尽管转录和前体mRNA加工之间的功能偶联已经确立，但其潜在机制尚未完全理解。我们展示了关键转录终止因子RNA外切核酸酶Xrn2与Pol II结合形成稳定复合物。Xrn2活性被Spt5刺激，以确保新生RNA的有效降解，导致Pol II从DNA上脱离。我们的结果支持一个模型，即Xrn2首先与延伸中的Pol II形成稳定复合物，以实现其降解新生RNA的完全活性，修正了当前的“鱼雷”终止模型，该模型认为RNA降解先于Xrn2与Pol II的结合。Spt5也是减弱非编码转录物表达、协调前体mRNA剪接和3'端加工的关键因子。我们的发现表明，与转录中的Pol II结合是调节RNA酶（如Xrn2）活性的重要调控步骤，从而推进了我们对转录过程中RNA成熟如何被控制的理解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Spt5在转录终止中的分子功能及其与Xrn2的关系；Xrn2如何与Pol II结合并发挥其外切核酸酶活性以促进终止。
- 核心机制
- Xrn2通过其柔性环区域与Pol II的Rpb2/Rpc10表面结合形成稳定复合物，Spt5的Kow5-CTR结构域刺激Xrn2的RNA降解活性，从而在CPA切割后促进Pol II从DNA上脱离。
- 主要证据
- 体外重建复合物显示Xrn2与Pol II结合；交联质谱和cryo-EM确定Xrn2-Pol II界面；RNA降解实验显示Spt5刺激Xrn2活性；体内实验显示Xrn2催化失活导致转录通读，Spt5耗竭导致Xrn2染色质关联丢失和终止缺陷。
- 研究意义
- 确立了Xrn2在转录复合物中作为Pol II结合因子发挥作用而非先降解RNA再结合Pol II的模型，为真核生物转录终止机制提供了分子基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外重建与结构分析
验证Xrn2-Rai1与Pol II-DSIF复合物的物理相互作用并确定结合位点。
纯化Pol II、Spt4/5、Xrn2/Rai1，组装DNA/RNA支架复合物，进行尺寸排阻色谱、交联质谱和cryo-EM结构解析。
验证Xrn2与Pol II的相互作用界面
通过突变Xrn2中预测的相互作用区域，验证其与Pol II结合的关键残基。
构建Xrn2突变体（R492E/R496E等），通过pull-down检测与Pol II的结合能力，并通过ChIP-seq分析体内招募效率。
检测Spt5对Xrn2活性的影响
探究Spt5是否直接刺激Xrn2的RNA降解活性。
使用FAM标记的RNA底物进行体外RNA降解实验，比较有无Spt5或Kow5-sCTR存在时Xrn2的活性。
评估Xrn2催化活性对Pol II脱离和体内终止的影响
确定Xrn2的催化活性在转录终止中的必要性。
使用体外终止实验检测Xrn2对Pol II脱离DNA的影响；通过AID系统耗竭Xrn2并表达WT或突变体（D235A），进行TT-seq全局分析，以及Pho1报告基因检测终止效率。
评估Spt5耗竭对转录延伸、终止和RNA成熟的影响
分析Spt5在转录和RNA加工中的多功能作用。
通过TT-seq和ChIP-seq分析Spt5耗竭后全球转录变化，包括延伸缺陷、终止通读、剪接缺陷和Xrn2招募。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 菌株构建 | 菌株背景：裂殖酵母；基因标签：AID-Flag标签用于Xrn2和Spt5的降解；Xrn2表达：V5标签的WT或D235A突变体，位于ura4位点 阅读提示：Methods: Strain construction and growth |
| Spt5蛋白纯化 | 缓冲液配方，蛋白酶和磷酸酶抑制剂组合；裂解方法：冷冻研磨；免疫沉淀条件：α-Flag M2琼脂糖，洗脱：0.2 M甘氨酸pH2.5 阅读提示：Methods: Purification of native Spt5 complexes |
| Pol II纯化 | 裂解方式（冷冻研磨或French Press）；α-Flag M2琼脂糖；洗脱：Flag肽；离子交换层析：HiTrap Q HP，线性梯度洗脱 阅读提示：Methods: Pol II purification |
| 重组蛋白表达 | 表达菌株：Rosetta (E. coli)；诱导条件：IPTG 0.3 mM，20°C 12-15 小时；纯化策略：Xrn2利用His标签，Rai1利用Strep标签，Spt4/5和Kow5-sCTR利用His标签 阅读提示：Methods: Recombinant protein expression and purification |
| RNA降解实验 | RNA底物：P-RNA-FAM (26 nt)；反应缓冲液：RB or SB；反应时间点：3、6、10、20分钟；Spt5刺激条件：Spt4/5 (或Kow5-sCTR)预孵育10分钟 阅读提示：Methods: RNA degradation activity assays/RNA binding |
| 体外终止实验 | Pol II复合物组装：scaffold 1a，RNA为P-RNA-FAM；链霉亲和素磁珠固定；蛋白：Xrn2 WT或突变体，RNase If；反应缓冲液：RB（25 mM HEPES pH7.9, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 4 mM ATP）；孵育：10 min, 25°C，然后加300 mM NaCl 阅读提示：Methods: Termination assay |
| TT-seq | 菌株生长和药物处理：YES培养基，生长至OD600~0.5，1 mM auxin处理2小时，4-tU标记浓度5 mM，时间6分钟；spike-in：S. cerevisiae比例100:1；RNA提取方法：热酚法；文库构建：NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit 阅读提示：Methods: TT-seq and Bioinformatic analyses |
| ChIP-seq | 交联条件：1/10体积CXF buffer处理20分钟；染色质剪切：Bioruptor Pico，2×35循环；抗体：Pol II抗体8WG16 (GeneTex) 15μL/60μL beads，V5标签抗体MCA1360 (Bio-Rad) 20μL；盐浓度350 mM NaCl；去交联条件：65°C过夜 阅读提示：Methods: ChIP-seq and analysis of RNA Polymerase II and Xrn2 occupancy |
| cryo-EM | 样本组装顺序：Pol II+RNA/template DNA 15min，然后加non-template DNA，再加Spt5（3倍摩尔过量），冰上10min；凝胶过滤纯化；交联：0.1%戊二醛10min冰上；定量：约0.7 mg/mL；制样参数：Quantifoil R2/1 gold grids, 3.5μL, blot 3.5s, force -25；数据收集：Titan Krios G3i, K2 Summit, 总剂量42.5 e-/Ų 阅读提示：Methods: Cryo-EM complex preparation, Cryo-EM image collection and processing |