计算机辅助设计与虚拟筛选
基于INDO 11M母核设计并筛选潜在的Haspin抑制剂。
使用CombiGlide生成虚拟库，经Qikprop、LigFilter过滤，通过Glide分子对接（HTVS、SP、XP精度）筛选化合物。
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一类新型吲哚类选择性Haspin抑制剂的全面的体外表征
A Comprehensive In Vitro Characterization of a New Class of Indole-Based Compounds Developed as Selective Haspin Inhibitors.
实验完整度
高包含分子对接虚拟筛选、体外激酶抑制FRET实验、多株肿瘤细胞系细胞活性MTT、Western blot、流式细胞术、免疫荧光、2D及3D模型联用、激酶选择性及药代稳定性评估。
主要模型
HeLa细胞系 Raji细胞系 A375细胞系 MiaPaca2细胞系 MCF7细胞系 HeLa球形3D模型
重点核对
化合物47和60对Haspin的IC50（分别为13.15±2.12 μM和1.0×10-5±0.4×10-6 μM） 细胞系：HeLa、Raji、A375、MiaPaca2、MCF7、IEC-6 处理浓度范围0.040–40 μM，处理时间72小时 与紫杉醇联用浓度（1 nM）及EC50值 激酶选择性检测（70种激酶，1 μM）
摘要
Haspin是一种新兴但尚未充分探索的分化激酶，通过调控有丝分裂期参与肿瘤生长。本文报道了一系列作为强效Haspin抑制剂的取代吲哚的计算机辅助设计、合成及生物学表征。合成的衍生物通过FRET分析评估，显示出非常强的Haspin抑制作用。随后，全面的细胞内研究凸显化合物47和60为最有前景的抑制剂。这些化合物在2D和3D细胞模型中与紫杉醇联合使用，显示出将紫杉醇抗肿瘤活性提高两倍的协同作用。化合物60在70种不同激酶的小组中也表现出显著的选择性。最后，计算机研究为开发新的Haspin抑制剂所需的化学要求提供了新见解。生物学结果以及47和60的药物相似性特征使得这些衍生物值得进一步研究。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 开发新型吲哚类化合物作为选择性Haspin抑制剂，并评估其抗肿瘤潜力及与紫杉醇的协同作用。
- 核心机制
- 化合物通过抑制Haspin激酶活性，阻断组蛋白H3T3磷酸化，导致有丝分裂纺锤体异常和多极纺锤体形成，引起细胞周期阻滞和有丝分裂灾难。
- 主要证据
- FRET实验显示强效Haspin抑制作用；Western blot验证H3T3磷酸化阻断；免疫荧光显示纺锤体异常；2D和3D模型显示与紫杉醇协同增强抗肿瘤活性。
- 研究意义
- 化合物47和60作为有前景的Haspin抑制剂，具有与紫杉醇协同作用的潜力，为进一步药物化学研究提供起点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
化学合成
合成筛选出的吲哚衍生物。
通过偶联、Mannich反应、Boc脱保护、还原胺化等步骤合成化合物15-20、28-34、37、40、41、47、49-60。
体外激酶抑制活性评价
确定化合物对Haspin的抑制活性。
使用LANCE Ultra TR-FRET技术测定化合物的IC50值。
细胞毒性评价
评估化合物对肿瘤细胞系的细胞毒性作用。
使用MTT法检测化合物对Raji、HeLa、A375、MiaPaca2、MCF7及正常IEC-6细胞系的活力影响。
细胞内Haspin抑制验证
验证化合物在细胞内抑制Haspin介导的H3T3磷酸化及细胞周期影响。
使用组蛋白提取、Western blot检测H3T3磷酸化水平；利用碘化丙啶染色流式细胞术分析细胞周期和凋亡。
免疫荧光分析
评估化合物对有丝分裂纺锤体形态和H3T3磷酸化水平的影响。
通过免疫荧光染色观察α-微管蛋白和p-H3T3，量化纺锤体异常和磷酸化水平。
与紫杉醇协同作用研究
评估化合物47和60与紫杉醇联用的协同抗肿瘤效果。
在2D和3D细胞模型（HeLa球体）中进行联合治疗，通过MTT和细胞死亡分析评估效果。
激酶选择性评估
确定化合物60对Haspin的选择性。
使用LANCE Ultra TR-FRET法测试化合物对一组有丝分裂相关激酶（CDK2, CDK5, CDK9, GSK3α/β, CDK1, Aurora B）的抑制活性；并对化合物60进行70种激酶的单一浓度（1 μM）筛选。
体外药代稳定性评估
评估化合物47和60的化学和代谢稳定性。
使用LC-MS方法检测化合物在模拟胃液/肠液、人/大鼠血浆和人肝微粒体中的稳定性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 酶活性检测 | ULight-组蛋白H3 (Thr3/Ser10)肽 | PerkinElmer | -- |
| 铕标记抗磷酸化组蛋白H3 (Thr3)抗体 | PerkinElmer | -- | |
| 三磷酸腺苷 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 人Haspin激酶 | GenScript | -- | |
| CDK1/CycB1 | ProQinase | 0134-0135p1 | |
| Aurora B激酶 | ProQinase | 0190-0000-1 | |
| CDK2/CycA2 | Carna Biosciences | 04-103 | |
| CDK5/p25 | Carna Biosciences | 04-106 | |
| CDK9/CycT1 | Carna Biosciences | 04-110 | |
| GSK3α | Carna Biosciences | 04-140 | |
| GSK3β | Carna Biosciences | 04-141 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| RPMI 1640培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素 | -- | -- | |
| 链霉素 | -- | -- | |
| 胰岛素 | -- | -- | |
| 胰蛋白酶 | -- | -- | |
| 细胞活性检测 | MTT | -- | -- |
| 紫杉醇 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 细胞周期分析 | 碘化丙啶 | -- | -- |
| 抗体 | 抗磷酸化组蛋白H3 Thr3抗体 | Sigma-Aldrich | -- |
| Western blot | 抗细胞周期蛋白E1抗体 | Elabscience | -- |
| 抗细胞周期蛋白A2抗体 | Elabscience | -- | |
| 免疫荧光 | 抗α-微管蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | -- |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 显微技术 | TCS SP5共聚焦显微镜 | Leica Microsystems | -- |
| LC-MS分析 | Nexera UHPLC系统 | Shimadzu | -- |
| LC-MS-2020质谱仪 | Shimadzu | -- | |
| BIOshell A160 Peptide C18 HPLC色谱柱 | Sigma-Aldrich | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 化合物处理 | 处理浓度、时间、溶剂（DMSO）浓度 阅读提示：见Experimental Section: In-Cell Experiments, Cell Viability Assay |
| 细胞培养 | 细胞系、培养基类型、血清浓度、培养条件（37°C, 5% CO2） 阅读提示：见Experimental Section: In-Cell Experiments, Cell Cultures |
| 激酶活性检测 | 激酶浓度、ATP浓度、底物浓度、孵育时间、缓冲液组成 阅读提示：见Experimental Section: TR-FRET Assays |
| 细胞周期分析 | 细胞处理时间、PI染色条件 阅读提示：见Experimental Section: Determination of Hypodiploid Nuclei and Cell Cycle |
| Western blot | 细胞处理时间、抗体稀释比、上样量 阅读提示：见Experimental Section: Metaphase Block and Histone Extraction for Western Blotting Analysis |
| 免疫荧光 | 处理时间、固定、透化、抗体稀释比 阅读提示：见Experimental Section: Indirect Immunofluorescence |
| 3D培养 | 细胞数量、培养时间、处理浓度、球体计数方法 阅读提示：见Experimental Section: 3D Cell Culture Generation and Mortality Determination |