ATG7敲低对PB-HSPCs髓系分化的影响
探究ATG7在人类髓系/粒细胞分化中对MPs增殖的作用
使用慢病毒shRNA敲低PB-HSPCs中的ATG7，经IL-3和G-CSF诱导髓系分化，通过流式、细胞周期和凋亡检测评估MPs增殖。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
自噬对于人类骨髓生成至关重要
Autophagy is essential for human myelopoiesis.
实验完整度
高包含体外细胞系、CRISPR敲除、shRNA敲低、过表达回补、RNA-seq、CoIP、共定位分析及CFU等多种独立证据层级，并进行了功能与机制验证。
主要模型
人外周血动员的CD34+ HSPCs H1人胚胎干细胞（H1 hESCs）及其来源的HSPCs MS5共培养体系
重点核对
ATG7敲低或敲除的效率验证 髓系分化过程中MPs的增殖能力与细胞周期分布 p53蛋白水平及p53信号通路相关基因表达 自噬活性（LC3B斑点）及Baf-A1抑制自噬的影响 ATG7突变体（ATG7▲C）是否恢复自噬及MP增殖
摘要
在这篇文章中，Pan及其同事表明，ATG7是自噬的关键因子，对于人类骨髓生成过程中由外周血造血干细胞或人胚胎干细胞衍生的造血干细胞来源的髓系祖细胞的快速增殖至关重要。在机制上，p53蛋白与LC3B（一种与自噬体货物相互作用的重要衔接蛋白）相关，而ATG7缺乏会减少p53在溶酶体中的定位，从而可能影响自噬介导的降解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 人类骨髓生成中，髓系祖细胞（MPs）在紧急髓系造血过程中的快速增殖是由何种细胞内机制调控的？
- 核心机制
- ATG7介导的自噬通过溶酶体途径降解p53蛋白，从而抑制p53信号通路，维持MPs的快速增殖。
- 主要证据
- ATG7敲低或敲除的HSPCs在向髓系分化时MPs增殖严重受损，p53蛋白水平升高而TP53 mRNA不变；CoIP显示p53与LC3B结合，且p53与LAMP2共定位减少；Baf-A1抑制自噬后p53积累且增殖受损；p53敲低部分回救增殖缺陷。
- 研究意义
- 揭示了自噬在人类骨髓生成中调控MPs增殖的全新机制，为理解骨髓生成及白血病中自噬的作用提供了新视角，并提示抑制自噬介导的p53降解可能成为AML治疗的潜在策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
转录组分析ATG7敲低后的基因表达变化
揭示ATG7敲低导致MPs增殖缺陷的分子机制
对SCR或shATG7转导的PB-HSPCs分化第7天的mCherry+CD45+细胞进行RNA-seq，分析差异表达基因及通路富集。
ATG7敲除hESCs来源MPs的表型验证
验证ATG7在hESC造血分化中对MPs增殖的必要性
通过CRISPR/Cas9在H1 hESCs中敲除ATG7，利用单层分化方案获得HSPCs，再经IL3/G-CSF诱导或MS5共培养或CFU实验检测MPs生成与增殖。
ATG7功能依赖性验证与回补实验
确认ATG7通过自噬依赖方式调控MPs增殖
在ATG7−/− hESCs中通过Tet-on系统过表达全长ATG7或自噬缺陷突变体ATG7▲C，检测自噬恢复情况及MPs增殖；另在H1细胞过表达ATG7进行CFU和MS5共培养。
自噬调控p53降解的机制验证
证明自噬通过降解p53调控MPs增殖
通过WB检测ATG7缺陷细胞中p53蛋白水平；通过CoIP检测p53与LC3B结合；通过免疫荧光检测p53与LAMP2共定位；使用Baf-A1抑制自噬观察p53积累及增殖影响；并通过shRNA敲低p53看是否回救增殖缺陷。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | mTeSR1培养基 | Stem Cell Technologies | -- |
| 基质胶 | BD Biosciences | -- | |
| 基因编辑 | PX459载体 | -- | -- |
| Accutase酶 | Sigma | -- | |
| Y-27632 | Sigma | -- | |
| 嘌呤霉素 | Gibco | -- | |
| 多西环素 | Beyotime | -- | |
| 基因敲低 | pLKO.1-mCherry/GFP载体 | -- | -- |
| SCGM培养基 | CellGenix | -- | |
| 干细胞因子 | PeproTech | -- | |
| 促血小板生成素 | PeproTech | -- | |
| Flt3配体 | PeproTech | -- | |
| 造血分化 | 骨形态发生蛋白4 | PeproTech | -- |
| 激活素A | Sino Biological | -- | |
| 碱性成纤维细胞生长因子 | Sino Biological | -- | |
| CHIR99021 | Selleck | -- | |
| LY294002 | Selleck | -- | |
| A8301 | Selleck | -- | |
| IWR-1-endo | Selleck | -- | |
| 血管内皮生长因子 | Sino Biological | -- | |
| SB431542 | Selleck | -- | |
| 白细胞介素3 | Sino Biological | -- | |
| 白细胞介素6 | Sino Biological | -- | |
| 髓系分化 | RPMI 1640培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | VISTECH | -- | |
| GlutaMAX添加剂 | Gibco | -- | |
| 粒细胞集落刺激因子 | Sino Biological | -- | |
| 人白细胞介素3 | Sino Biological | -- | |
| 流式细胞术 | CytoFLEX流式细胞仪 | Beckman | -- |
| 细胞周期分析 | Click-iT EdU Pacific Blue流式细胞术检测试剂盒 | Invitrogen | -- |
| DAPI | Beyotime | -- | |
| 细胞周期与凋亡分析试剂盒 | Beyotime | -- | |
| 凋亡分析 | Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒 | Vazyme | -- |
| qRT-PCR | RaPure总RNA微量提取试剂盒 | Magen | -- |
| HiScript II第一链cDNA合成试剂盒 | Vazyme | -- | |
| ChamQ SYBR qPCR预混液 | Vazyme | -- | |
| CFX96实时荧光定量PCR仪 | Bio-Rad | -- | |
| 免疫共沉淀 | Triton X-100 | Sigma | -- |
| 甘油 | DAMAO | -- | |
| 蛋白A/G琼脂糖珠 | Novex | -- | |
| CFU实验 | Methocult H4435甲基纤维素培养基 | Stem Cell Technologies | -- |
| 吉姆萨染色 | May-Grunwald-Giemsa染液 | Baso | -- |
| MS5共培养 | DuP-697 | BioVision | -- |
| 白细胞介素2 | PeproTech | -- | |
| 白细胞介素15 | Sino Biological | -- | |
| OP9-hDL4共培养 | 白细胞介素7 | Sino Biological | -- |
| 免疫荧光 | LSM800共聚焦显微镜 | Carl Zeiss | -- |
| RNA-seq | MoFlo Astrios流式分选仪 | Beckman | -- |
| TRIzol试剂 | Invitrogen | -- | |
| VAHTS mRNA-seq V3文库制备试剂盒（Illumina） | Vazyme | -- | |
| NextSeq 500 Mid Output测序试剂盒 | Illumina | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| ATG7敲低与髓系分化 | PB-HSPCs的分离或冻存来源；慢病毒感染前培养时间30 h；感染时间36 h；MOI=100或150；髓系分化培养基中G-CSF和hIL3浓度分别为100 ng/mL和20 ng/mL；分化时间及检测时间点 阅读提示：Methods: Gene knockdown in PB-HSPCs or hESC-HSPCs; Myeloid/granulocyte differentiation; Figure 1 legend |
| ATG7敲除hESCs生成与分化 | H1 hESCs的基因敲除效率；单层造血分化方案中细胞因子组合及时间；髓系分化及MS5共培养的细胞数和因子浓度；CFU实验接种细胞数和培养时间 阅读提示：Methods: Gene knockout and overexpression in hESCs; Hematopoietic differentiation with hESCs; MS5 co-culture assay; CFU assay; Figure 3 legend |
| 自噬活性检测 | Baf-A1处理浓度和时间（50 nM，2 h）；LC3B斑点的观察和分析参数 阅读提示：Figure 1B-1C legend; Methods: Immunofluorescence and data processing |
| p53蛋白检测与机制验证 | 分化天数（第6天）；CoIP中细胞裂解量和抗体；免疫荧光共定位分析中Manders'系数计算 阅读提示：Figure 5A-5E legend; Methods: CoIP; Immunofluorescence and data processing |
| RNA-seq分析 | 取样时间点（第7天）；分选标记（mCherry+CD45+）；差异基因筛选阈值；测序平台 阅读提示：Figure 2A legend; Methods: RNA-seq and analysis |