建立SA-AKI小鼠模型并确定损伤时点
验证LPS腹腔注射能否诱导SA-AKI，并确定肾脏损伤最严重的时间点。
健康C57BL/6小鼠腹腔注射LPS（15 mg/kg）建立SA-AKI模型，对照组注射等量生理盐水。在不同时间点（1、6、12、24、48小时）检测血清Scr和BUN水平，评估肾损伤进展。
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褪黑素在脓毒症相关急性肾损伤中的潜力：线粒体保护与cGAS-STING信号通路
The potential of melatonin in sepsis-associated acute kidney injury: Mitochondrial protection and cGAS-STING signaling pathway.
实验完整度
高体内实验采用LPS诱导的SA-AKI小鼠模型，结合肾功能、组织病理、Western blot、qRT-PCR、TEM、TUNEL等多层次分子病理学验证，并使用H151进行干预对照。
主要模型
C57BL/6小鼠LPS诱导的SA-AKI模型 小鼠肾小管上皮细胞
重点核对
SA-AKI模型建立：腹腔注射LPS（15 mg/kg）诱导，24小时为检测时间点。 给药方案：Mel（30 mg/kg）于LPS注射前3小时及后6、12小时腹腔注射；H151（10 mg/kg）于LPS注射前3小时腹腔注射。 肾功能指标：检测血清肌酐（Scr）和血尿素氮（BUN）水平。 cGAS-STING通路分析：检测cGAS、STING、NF-κB、IRF3及其磷酸化蛋白的表达。 线粒体自噬评估：通过qRT-PCR检测mtDNA含量，Western blot检测PINK1、p62、LC3蛋白，TEM观察自噬体和自溶酶体数量。
摘要
褪黑素（Mel）已知具有多种生物学功能，如抗氧化和抗炎能力，以及调节免疫反应的能力，这些功能可以保护线粒体并改善脓毒症相关急性肾损伤（SA-AKI）的预后。然而，关于Mel如何发挥其免疫调节功能的理论众多，至今尚未达成共识。我们提出Mel对线粒体的保护作用与免疫炎症反应中的环状GMP-AMP合酶（cGAS）-干扰素基因刺激因子（STING）信号通路密切相关。我们将H151和Mel腹腔注射到SA-AKI小鼠模型中，以干扰cGAS-STING信号通路。通过比较行为学、病理学和分子生物学结果，我们发现Mel可以下调cGAS-STING信号通路，同时显著减轻肾脏损伤和改善肾功能。此外，经Mel处理的小鼠自噬体形成显著增加，这可能与cGAS-STING信号通路有关。我们的研究结果表明，Mel对SA-AKI小鼠肾损伤的保护作用部分归因于抑制cGAS-STING信号通路。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 褪黑素是否能通过保护线粒体和调节cGAS-STING信号通路来改善脓毒症相关急性肾损伤（SA-AKI）的预后？
- 核心机制
- 褪黑素促进PINK1/p62/LC3介导的线粒体自噬，减少损伤线粒体释放的mtDNA，从而抑制cGAS-STING信号通路的激活，减轻炎症反应和肾损伤。
- 主要证据
- 在LPS诱导的SA-AKI小鼠模型中，褪黑素干预后STING、IRF3、NF-κB及其磷酸化蛋白表达下调，炎症因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）水平降低，肾脏组织病理和TUNEL凋亡减少，mtDNA含量降低，自噬体形成增加。
- 研究意义
- 研究提示褪黑素作为临床常用激素，在SA-AKI相关炎症损伤中具有巨大的治疗潜力，为减轻SA-AKI相关炎症提供了新的治疗途径。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证cGAS-STING信号通路在SA-AKI中的作用
探究cGAS-STING信号通路是否参与SA-AKI的肾损伤和炎症。
采用Western blot和qRT-PCR检测SA-AKI小鼠肾组织中cGAS、STING、NF-κB、IRF3及其磷酸化蛋白的表达，并检测炎症因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）的mRNA水平。
评估褪黑素对SA-AKI肾损伤的改善作用
检验褪黑素能否改善SA-AKI小鼠的肾功能和组织病理损伤。
对四组小鼠进行肾功能检测（Scr、BUN）、肾组织H&E染色评估病理损伤，并进行MSS评分评估脓毒症严重程度。
检测线粒体自噬相关蛋白表达
探究褪黑素是否影响线粒体自噬相关蛋白PINK1、p62和LC3的表达。
通过Western blot检测肾组织中PINK1、p62、LC3I/II蛋白表达水平。
观察线粒体形态和自噬体形成
通过透射电镜直接观察褪黑素对线粒体形态和自噬体形成的影响。
使用透射电镜观察肾小管上皮细胞的线粒体超微结构，计算自噬体和自溶酶体的数量。
检测线粒体DNA含量与凋亡
评估褪黑素对肾组织mtDNA含量和细胞凋亡的影响。
通过qRT-PCR检测肾组织中mtDNA相对含量，使用TUNEL染色评估肾小管细胞凋亡。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | C57BL/6小鼠 | Jiangsu Kerbio Medical Technology Group Co., Ltd | -- |
| 脂多糖 | Sigma Aldrich | -- | |
| 药物处理 | 褪黑素 | Medchemexpress | -- |
| H-151 | Medchemexpress | -- | |
| Western blot | cGAS抗体 | Cell Signaling Technology | -- |
| STING抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| NF-κB抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| p-NF-κB抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| IRF-3抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| p-IRF-3抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| SQSTM1/p62抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| LC3抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| PINK1抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 肾功能检测 | AU5800全自动生化分析仪 | -- | -- |
| ELISA | 小鼠IL-1β ELISA试剂盒 | R&D Systems | -- |
| IL-6 ELISA试剂盒 | Invitrogen | -- | |
| qRT-PCR | Trizol试剂 | -- | -- |
| RevertAid第一链cDNA合成试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| CFX96实时荧光定量PCR检测系统 | Bio-Rad | -- | |
| TB Green Premix Ex Taq | Takara | -- | |
| DNeasy血液和组织试剂盒 | Qiagen | -- | |
| SyBR GreenER qPCR超混合液 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Western blot | TGrinder H24组织研磨器 | TIANGEN | -- |
| 总蛋白提取试剂盒 | BestBio | -- | |
| 聚偏二氟乙烯膜 | -- | -- | |
| 山羊抗兔抗体 | -- | -- | |
| Tanon 4600SF化学发光成像系统 | Tanon | -- | |
| 组织病理 | 自动脱水机dakewehp300 | Dakewe | -- |
| TUNEL染色 | 一步法TUNEL原位凋亡检测试剂盒 | Elabscience | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型建立 | C57BL/6小鼠（雄性，6-8周龄，16-20g）；LPS剂量15 mg/kg腹腔注射；对照组注射等量0.9%生理盐水；检测时间点24小时。 阅读提示：见Methods 2.1和2.3节。 |
| 药物处理 | Mel剂量30 mg/kg，于LPS前3小时及后6、12小时腹腔注射；H151剂量10 mg/kg，于LPS前3小时腹腔注射。 阅读提示：见Methods 2.3节。 |
| 肾功能检测 | 血清肌酐（Scr）和血尿素氮（BUN）水平检测，采血前禁食至少12小时，使用AU5800自动生化分析仪。 阅读提示：见Methods 2.4节。 |
| 分子生物学检测 | cGAS-STING通路蛋白（cGAS, STING, NF-κB, p-NF-κB, IRF-3, p-IRF-3）和线粒体自噬蛋白（PINK1, p62, LC3）表达，使用Western blot和qRT-PCR；mtDNA含量检测通过qRT-PCR。 阅读提示：见Methods 2.7, 2.8, 2.9节。 |
| 组织病理学检测 | H&E染色评估肾小管损伤评分；TUNEL染色评估凋亡细胞数；透射电镜观察线粒体形态和自噬体数量。 阅读提示：见Methods 2.10, 2.11, 2.12节。 |