RNA-seq分析Rbm4敲除胚胎脑的剪接变化
鉴定Rbm4敲除导致的差异剪接事件，特别是内含子保留。
对E13.5野生型和Rbm4dKO脑进行RNA-seq分析，使用rMATS鉴定剪接事件，并进行GO富集分析。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
RBM4介导的Hsf1内含子切除诱导BDNF促进小脑叶形成
RBM4-mediated intron excision of Hsf1 induces BDNF for cerebellar foliation.
实验完整度
高研究包含体外颗粒细胞培养、体内Rbm4敲除小鼠模型、RNA-seq分析及功能回补实验，并进行了机制验证（NMDAR信号、CU基序、PTB拮抗）。
主要模型
E13.5小鼠胚胎脑组织 P7小脑颗粒细胞（GCs） Rbm4敲除小鼠（Rbm4dKO） Hsf1小基因（minigene）报告系统
重点核对
Rbm4敲除小鼠的基因型确认 Hsf1内含子6保留的RT-PCR检测 HSF1和BDNF蛋白水平免疫印迹 NMDA处理浓度（25 µM）和时间（1小时） NMDAR信号通路抑制剂（AP5、EGTA、CK59、SRPIN340）
摘要
脑源性神经营养因子（BDNF）在大脑发育和神经功能中发挥重要作用。剪接调节因子RBM4的组成性敲除降低了发育中大脑的BDNF表达，并导致小脑发育不全，这是一种自闭症样特征。在这里，我们表明Rbm4敲除诱导Hsf1的内含子6保留，导致HSF1蛋白及其下游靶标BDNF的下调。RBM4介导的Hsf1内含子切除调节了培养的颗粒细胞中BDNF的表达。HSF1的异位表达恢复了Rbm4敲除小鼠的小脑叶形成和运动学习，表明RBM4-HSF1-BDNF在小脑叶形成中的关键作用。此外，N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDAR）信号传导促进了RBM4的表达和核转位，因此增加了HSF和BDNF的表达。一个短的CU富集基序负责NMDAR和RBM4介导的内含子切除。最后，RBM4和聚嘧啶束结合（PTB）蛋白在内含子切除中起拮抗作用，表明剪接调控在BDNF表达中的作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- RBM4如何通过剪接调控BDNF表达，以及此过程在小脑叶形成中的作用是什么？
- 核心机制
- RBM4介导Hsf1内含子6的切除，增加HSF1蛋白水平，HSF1进而反式激活BDNF转录；NMDAR信号通过CaMKII和SRPK1磷酸化RBM4，促进其核转位和稳定性，增强该剪接调控。
- 主要证据
- Rbm4敲除导致Hsf1内含子6保留和HSF1/BDNF下调；在颗粒细胞中敲低或过表达RBM4影响内含子切除及HSF1/BDNF水平；HSF1过表达恢复Rbm4dKO小鼠的BDNF表达、小脑叶形成和运动学习；NMDA处理促进内含子切除，且RBM4敲低消除此效应。
- 研究意义
- 揭示RBM4-HSF1-BDNF调控轴在小脑叶形成中的关键作用，为神经发育障碍的治疗提供潜在策略，通过激活剪接可能成为治疗方向。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证RBM4靶基因的剪接变化
验证RNA-seq结果中CES和IR类别中的代表性基因。
通过RT-PCR验证CES类基因（如Nrxn2、Cacna1d等）和IR类基因（如Hsf1、hnRNPs等）的剪接变化。
验证RBM4对Hsf1内含子6切除的调控
确定RBM4是否直接调控Hsf1内含子6的切除并影响HSF1和BDNF表达。
在培养的P7颗粒细胞中敲低或过表达RBM4，检测Hsf1内含子6保留和HSF1/BDNF蛋白水平。
评估HSF1对BDNF表达和功能的必要性
检验HSF1是否是BDNF表达所必需的，以及其过表达能否回补Rbm4敲除的表型。
在颗粒细胞中敲低HSF1，观察BDNF水平；在Rbm4dKO小鼠脑中过表达HSF1-DsRed，检测BDNF表达、小脑叶形成和运动学习。
研究NMDAR信号对RBM4介导剪接的调控
探究神经元信号如何影响RBM4介导的Hsf1内含子切除。
用NMDA或DCS处理颗粒细胞，检测Hsf1剪接和HSF1/BDNF表达；使用AP5、EGTA、CK59、SRPIN340等抑制剂阻断信号通路，观察效应。
研究NMDAR信号对RBM4蛋白丰度和定位的影响
确定NMDAR信号是否通过影响RBM4的丰度和核转位来调控剪接。
检测NMDA处理对RBM4蛋白水平和亚细胞定位的影响；使用RBM4 S309A突变体验证磷酸化在其中的作用。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| RNA-seq分析 | rMATS | -- | -- |
| 质粒构建 | pCH110载体 | Addgene | -- |
| pCAG-DsRed载体 | Addgene | #11151 | |
| 细胞培养 | 木瓜蛋白酶解离系统试剂盒 | Worthington | LK003150 |
| Neurobasal A培养基 | Gibco | 10888022 | |
| B27添加剂 | Gibco | 17504044 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 10378016 | |
| Smoothened激动剂（SAG） | Sigma-Aldrich | 566661 | |
| 药物处理 | NMDA | Sigma-Aldrich | M3262 |
| D-环丝氨酸 | Sigma-Aldrich | C6880 | |
| AP5 | Sigma-Aldrich | A8054 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| CK59 | Millipore | 208922-M | |
| SRPIN340 | MedChemExpress | HY-13949 | |
| RNA提取和RT-PCR | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | 15596018 |
| RT-PCR | SuperScript III第一链合成系统 | Thermo Fisher Scientific | 18080-044 |
| qPCR | PerfeCTa qPCR SuperMix | Quantabio | 95050-500 |
| LightCycler 480仪器II | Roche Applied Science | -- | |
| 免疫印迹 | 硝酸纤维素膜 | Hybond ECL | GERPN303D |
| 抗RBM4抗体 | ProteinTech | 11614-1-AP | |
| 抗HSF1抗体 | Proteintech | 51034-1-AP | |
| 抗hnRNPH1抗体 | Elabscience | E-AB-65522 | |
| 抗hnRNP L抗体 | Elabscience | E-AB-16484 | |
| 抗BDNF抗体 | Abcam | ab108319 | |
| 抗FLAG抗体 | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| 抗GAPDH抗体 | ProteinTech | 60004-1-Ig | |
| 抗PTBP1抗体 | Abcam | ab133734 | |
| 抗PTBP2抗体 | Abcam | ab228930 | |
| 抗Lamin A/C抗体 | Sigma-Aldrich | SAB4200236 | |
| 抗钙结合蛋白抗体 | Proteintech | 14479-1-AP | |
| 抗Pax6抗体 | Millipore | AB2237 | |
| 抗Akt抗体 | Cell Signaling Technology | 9272 | |
| 抗pAkt抗体 | Cell Signaling Technology | 9271 | |
| 抗ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 9102 | |
| 抗pERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 9101 | |
| 抗CC3抗体 | Cell Signaling Technology | 9664 | |
| 抗pCREB抗体 | Proteintech | 28792-1-AP | |
| Immobilon ECL底物 | Millipore | WBKLS0500 | |
| X光胶片 | FUJIFILM | Super RX-N | |
| ImageJ | NIH | version 1.52a | |
| 组织染色 | Leica CM3050S冷冻切片机 | Leica | -- |
| 动物实验 | 转棒仪 | Ugo Basile | 47600 Rota-Rod |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠模型 | Rbm4dKO小鼠基因型确认（PCR）；胚胎日龄（E13.5等）；动物伦理批准号。 阅读提示：Methods: Rbm4 knockout mice |
| 细胞培养 | P7小脑颗粒细胞分离；培养条件（Neurobasal A, B27, SAG等）；细胞密度。 阅读提示：Methods: Culture and transfection of cerebellar granule cells |
| 药物处理 | NMDA浓度（25 µM）和时间（1小时）；抑制剂浓度和预孵育时间；RBM4敲低或过表达。 阅读提示：Results: NMDA receptor signaling regulates RBM4-mediated intron excision of Hsf1; Methods: Pharmaceutical activation or inhibition of the NMDAR pathways |
| 剪接分析 | RT-PCR引物和条件；Hsf1内含子6保留检测方法；RNA提取和反转录条件。 阅读提示：Methods: RNA extraction and RT-PCR; Supplementary Table 1 |
| 体内回补实验 | E15.5侧脑室注射和电转参数（电压30V，5次）；HSF1-DsRed质粒浓度；取样时间点（P0, P30）。 阅读提示：Methods: In utero electroporation; Results: HSF1 rescues the foliation defects of Rbm4 knockout cerebellum |
| 行为学测试 | 小鼠年龄（6周）；rotarod预训练和测试速度参数；每组样本量（10只）。 阅读提示：Methods: Rotarod test; Figure 4E legend |