生成Gal-3敲除的MDA-MB-231细胞系
通过CRISPR/Cas9基因编辑获得Gal-3阴性克隆，为后续功能实验提供模型。
使用CRISPR/Cas9系统（Alt-R CRISPR-Cas9、4D电穿孔）编辑MDA-MB-231细胞，通过NGS和Sanger测序验证克隆，并通过RT-PCR、Western blot和流式细胞术确认Gal-3表达下调。
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三阴性乳腺癌细胞分泌的半乳糖凝集素-3调节T细胞功能
Galectin-3 secreted by triple-negative breast cancer cells regulates T cell function.
实验完整度
高包含CRISPR/Cas9基因编辑、体外共培养、动物模型、患者样本RNA-seq及功能验证（ROS、Treg、T耗竭）等多层级证据。
主要模型
MDA-MB-231三阴性乳腺癌细胞系 健康女性PBMC共培养模型 NSG小鼠异种移植瘤模型 TNBC患者PBMC样本
重点核对
Gal-3敲除克隆的生成与验证 体外PBMC共培养条件（细胞浓度、培养时间） 体内实验动物模型（NSG小鼠、PBMC接种时间） RNA-seq样本来源及去卷积分析 氧化磷酸化基因表达检测方法
摘要
三阴性乳腺癌（TNBC）是一种侵袭性亚型，占乳腺癌的10-15%。目前高危早期TNBC的治疗包括新辅助化疗免疫疗法。然而，免疫反应的巨大差异促使迫切需要新的免疫靶向药物。这需要全面了解TNBC的肿瘤微环境。我们最近证明，TNBC细胞分泌的半乳糖凝集素-3（Gal-3）结合蛋白/Gal-3复合物通过抑制T细胞中的CD45信号传导诱导免疫抑制。在此，我们进一步研究了TNBC中分泌的Gal-3与T细胞之间的相互作用。使用CRISPR/Cas9基因编辑TNBC MDA-MB-231细胞系，我们获得了Gal-3阴性（neg）克隆。我们在体外模型中研究了这些克隆，与外周血单核细胞（PBMC）共培养以模拟免疫-肿瘤相互作用，并在体内模型中植入小鼠。Gal-3neg肿瘤在小鼠中接种PBMC后肿瘤生长减慢。相反，Gal-3阳性（pos）肿瘤在接种PBMC后持续生长，肿瘤调节性T细胞（CD4/FoxP3+）浸润增加。对血浆Gal-3水平升高的TNBC女性T细胞的RNA测序显示，与健康女性T细胞相比，氧化磷酸化基因表达显著降低。同样，在我们的体外模型中，氧化磷酸化基因表达降低和线粒体功能障碍导致CD8细胞内活性氧显著增加。因此，与Gal-3pos TNBC共培养的PBMC中T耗竭细胞（CD8/PD1/Tim3/Lag3+）显著增加。总之，我们揭示了一种新的TNBC相关Gal-3抑制机制，涉及CD4调节性T细胞和CD8耗竭T细胞的上调。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TNBC细胞分泌的Gal-3如何影响T细胞功能，从而介导免疫抑制？
- 核心机制
- Gal-3通过上调CD4调节性T细胞（Treg）和诱导CD8 T细胞耗竭（表现为PD-1、Tim-3、Lag-3表达升高）来抑制抗肿瘤免疫。具体机制涉及Gal-3降低T细胞氧化磷酸化基因表达，导致线粒体功能障碍和ROS增加，最终促进T细胞耗竭。
- 主要证据
- 在体外共培养模型中，Gal-3阳性克隆或添加重组Gal-3可增加Treg比例及IL-10/IL-35分泌，并降低CD4+CD69+活化细胞比例；体内实验中，Gal-3阳性肿瘤小鼠肿瘤生长加快，Treg浸润增多，血清IL-35升高；RNA-seq和RT-PCR显示TNBC患者T细胞氧化磷酸化基因（SLC25A6、MDH2、GPI、GOT2）表达下调，且共培养中Gal-3阳性组CD8+细胞内ROS和T耗竭细胞比例增加。
- 研究意义
- 该研究揭示了TNBC分泌的Gal-3通过影响T细胞功能导致免疫逃逸的新机制，为理解TNBC免疫治疗反应差异提供了见解，并提示Gal-3可作为免疫治疗的潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外验证Gal-3对肿瘤细胞增殖和PBMC增殖的影响
评估Gal-3对肿瘤细胞自身增殖和免疫细胞增殖的作用。
比较Gal-3neg和Gal-3pos克隆的增殖能力（XTT实验）及3D球体形成能力；将PBMC与克隆上清共培养，或添加rGal-3，检测PBMC增殖。
体内验证Gal-3对肿瘤生长和Treg浸润的影响
在体内模型中观察Gal-3对肿瘤生长和免疫细胞浸润的作用。
将Gal-3neg和Gal-3pos克隆皮下注射NSG小鼠，一周后尾静脉注射健康供体PBMC，测量肿瘤体积，通过免疫荧光检测Treg（CD3+FOXP3+）浸润，并检测血清IL-35。
体外验证Gal-3对Treg和细胞因子的影响
在体外共培养系统中验证Gal-3对Treg诱导和细胞因子分泌的作用。
将PBMC与Gal-3neg或Gal-3pos克隆共培养，或添加rGal-3，通过流式细胞术检测Treg比例（CD4+CD25+FOXP3+），ELISA检测IL-10和IL-35分泌。
分析TNBC患者T细胞氧化磷酸化基因表达
评估TNBC患者T细胞与健康者相比的氧化磷酸化基因表达差异。
对4例TNBC患者和4例健康女性的PBMC进行RNA-seq，通过去卷积分析提取T细胞转录组，GSEA富集分析，并用RT-PCR验证关键基因表达。
验证Gal-3对CD8 T细胞ROS和耗竭的影响
检测Gal-3是否通过诱导氧化磷酸化基因下调导致ROS升高和T细胞耗竭。
在共培养模型中，使用流式细胞术检测CD8+细胞内ROS水平，并检测CD8+PD-1+Tim-3+Lag-3+细胞比例。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
基因编辑
验证细胞功能
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Biological Industries | -- |
| 胎牛血清 | Biological Industries | -- | |
| 青霉素 | Biological Industries | -- | |
| 硫酸链霉素 | Biological Industries | -- | |
| 制霉菌素 | Biological Industries | -- | |
| 支原体检测试剂盒 | Biological Industries | -- | |
| PBMC分离 | Ficoll-Paque Plus密度梯度分离液 | GE Healthcare | -- |
| PBMC培养 | RPMI培养基 | -- | -- |
| AB型血清 | Gibco | -- | |
| 药物处理 | 重组半乳糖凝集素-3 | R&D Systems | -- |
| T细胞分选 | Pan T细胞分选试剂盒 | Miltenyi Biotec | -- |
| 基因编辑 | Alt-R CRISPR-Cas9系统 | IDT | -- |
| 4D电穿孔系统 | Lonza | -- | |
| SE缓冲液 | Lonza | -- | |
| 基因编辑验证 | Trizol试剂 | Invitrogen | -- |
| Western blot | 生物素化的抗Gal-3抗体 | R&D Systems | -- |
| IRDye 800CW山羊抗兔二抗 | LI-COR | -- | |
| IRDye 680CW山羊抗小鼠二抗 | LI-COR | -- | |
| 流式细胞术 | 抗Gal-3-PE抗体 | R&D Systems | -- |
| 细胞增殖检测 | 细胞增殖检测试剂盒 | Sartorius | -- |
| 免疫荧光 | CD3-APC抗体 | Beckman Coulter | -- |
| FOXP3-FITC抗体 | R&D Systems | -- | |
| Gal-3-PE抗体 | R&D Systems | -- | |
| HLA-A抗体 | Abcam | ab52922 | |
| Alexa Fluor 488驴抗兔IgG二抗 | Jackson Immunoresearch Laboratories | -- | |
| DAPI染料 | Biolegend | BLG-422801 | |
| Leica TCS SP5共聚焦激光扫描显微镜 | Leica | -- | |
| 流式细胞术 | CD4-PC7抗体 | Beckman Coulter | -- |
| CD8-KO抗体 | Beckman Coulter | -- | |
| CD25-APC-AF750抗体 | Beckman Coulter | -- | |
| CD69-PC5抗体 | Beckman Coulter | -- | |
| PD1-AF647抗体 | R&D Systems | -- | |
| LAG3-AF700抗体 | R&D Systems | -- | |
| TIM3-AF405抗体 | R&D Systems | -- | |
| ROS检测 | 细胞ROS-FITC检测试剂盒 | Abcam | ab113851 |
| RNA-seq | RNeasy Plus微型试剂盒 | Qiagen | -- |
| RT-qPCR | High-Capacity RNA逆转录试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| SYBR Green荧光染料系统 | Applied Biosystems | -- | |
| StepOnePlus实时荧光定量PCR仪 | Applied Biosystems | -- | |
| 细胞因子检测 | ELISA Ready SET-Go试剂盒 | eBioscience | -- |
| 人IL-35 ELISA试剂盒 | Elabscience | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | MDA-MB-231细胞系来源（ATCC），培养基成分（DMEM、10% FCS、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、青霉素、链霉素、制霉菌素），培养条件（37°C、5% CO2），细胞代数不超过5代。 阅读提示：Methods: The cell line and cell cultures |
| 基因编辑 | CRISPR guide序列，电穿孔参数（4D电穿孔系统、SE缓冲液、程序CH125），单克隆筛选方法，基因编辑效率验证方法。 阅读提示：Methods: CRISPR/Cas9 genome editing of Gal-3 |
| PBMC分离 | Ficoll密度梯度离心条件（650×g, 30 min），PBMC来源（健康女性捐赠者），T细胞分选方法（Pan T isolation kit）。 阅读提示：Methods: PBMCs from healthy female volunteers, T cell isolation from PBMCs |
| 体外共培养 | PBMC与肿瘤细胞的共培养比例（PBMC 2×10^6/ml），培养天数（3或5天），rGal-3浓度（2μg/ml），抗体染色条件和浓度。 阅读提示：Methods: Flow cytometry analysis; Results: Secreted Gal-3 induced an increase in T-reg; Gal-3 induced intracellular ROS and an increase in T cell exhausted cells |
| 体内实验 | 小鼠品系和性别（NSG雌性，7-8周龄），肿瘤细胞注射数量（4×10^6），PBMC注射时间（肿瘤接种后1周），肿瘤体积测量方法，实验终点（PBMC注射后23天）。 阅读提示：Methods: Tumor xenograft growth in mice |
| RNA-seq分析 | RNA提取方法（RNeasy Plus mini kit），测序平台（Illumina），比对和定量工具（TopHat, htseq-count），差异表达分析（DESeq2），去卷积方法（CIBERSORTx, ABIS signature matrix），GSEA分析参数。 阅读提示：Methods: RNA sequencing |
| RT-qPCR验证 | RNA提取和cDNA合成方法，引物序列（可查补充表），内参基因（GAPDH），PCR条件（退火温度60°C）。 阅读提示：Methods: Oxidative phosphorylation gene expression; Supplementary Table 2 |