验证ClpP在IBD中的异常表达
确认ClpP在IBD患者和结肠炎小鼠模型中表达是否异常。
通过免疫组化、Western blot和公共数据库分析检测IBD患者结肠组织和DSS、IL-10 KO小鼠模型结肠中的ClpP表达，并通过单细胞测序数据分析特定免疫细胞亚群中的ClpP表达。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
化学激活线粒体ClpP以调节CD4+ T细胞的能量代谢治疗炎症性肠病
Chemical activation of mitochondrial ClpP to modulate energy metabolism of CD4+ T cell for inflammatory bowel diseases treatment.
实验完整度
高包含细胞实验、动物模型（DSS急性和IL-10 KO慢性结肠炎）、患者样本、单细胞测序、蛋白质组学等多层次证据，并进行了功能验证和机制验证。
主要模型
DSS诱导的急性结肠炎小鼠模型 IL-10敲除慢性结肠炎小鼠模型 小鼠原代CD4+ T细胞 溃疡性结肠炎患者结肠组织
重点核对
NCA029剂量：5, 10, 20 mg/kg，口服给药 DSS浓度：2.5%（w/v） CD4+ T细胞敲低ClpP后NCA029疗效消失 NCA029抑制ETC复合物I、III、IV活性 Th17/Treg细胞比例变化
摘要
张等人发现，化学激活线粒体ClpP会破坏线粒体呼吸链复合物，影响CD4+ T细胞的氧化磷酸化（OXPHOS）。这种破坏对调节Th17/Treg细胞平衡至关重要，最终减轻实验性炎症性肠病（IBD）的症状。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 化学激活线粒体ClpP是否通过调节CD4+ T细胞的能量代谢来治疗炎症性肠病？
- 核心机制
- NCA029激活ClpP，降解线粒体呼吸链复合物亚基，抑制OXPHOS，进而抑制STAT3磷酸化，降低RORγt表达，减少Th17细胞分化，促进Treg细胞分化，从而减轻炎症。
- 主要证据
- 在DSS和IL-10 KO小鼠模型中，NCA029口服给药显著缓解结肠炎症状，伴随Th17/Treg平衡改变和肠屏障修复；体外实验显示NCA029抑制CD4+ T细胞的OCR、ETC复合物活性和ATP生成，并诱导凋亡；ClpP敲低消除了NCA029的疗效。
- 研究意义
- 本研究提出了一种通过化学激活ClpP治疗IBD的策略，为IBD药物开发提供了候选化合物NCA029。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估ClpP表达对DSS结肠炎易感性的影响
确定ClpP表达水平是否影响DSS诱导的结肠炎严重程度。
通过AAV-shClpP和AAV-ClpP改变小鼠结肠ClpP表达，然后诱导DSS结肠炎，评估体重、结肠长度、DAI和组织学损伤，并分析Th17/Treg比例。
体外验证NCA029对CD4+ T细胞的作用
探究NCA029是否通过激活ClpP影响CD4+ T细胞凋亡、分化及代谢。
检测NCA029对HsClpP的激动活性，在DSS刺激的CD4+ T细胞中检测细胞活力、凋亡、ROS水平、OXPHOS（OCR）、STAT3/RORγt表达，以及Th17/Treg分化比例。
体内药效评估：DSS诱导的急性结肠炎模型
评估口服NCA029对DSS诱导的急性结肠炎的治疗效果。
在DSS诱导的急性结肠炎模型中，口服给予NCA029或tofacitinib，监测体重、DAI、生存率、结肠长度、组织学、炎症因子和肠屏障蛋白表达。
体内药效评估：IL-10 KO慢性结肠炎模型
评估NCA029对慢性结肠炎的治疗效果。
在IL-10 KO小鼠自发结肠炎模型中，口服给予NCA029或载体，监测体重、DAI、结肠长度、组织学、炎症因子和肠屏障蛋白表达。
体内验证NCA029靶向CD4+ T细胞中的ClpP
证明NCA029在体内通过靶向CD4+ T细胞中的ClpP发挥抗结肠炎作用。
使用抗CD4单克隆抗体耗竭CD4+ T细胞，然后回输正常或ClpP敲低的CD4+ T细胞，观察NCA029对结肠炎的影响。
蛋白质组学分析CD4+ T细胞代谢变化
揭示NCA029对CD4+ T细胞线粒体代谢网络的影响。
对DSS和NCA029处理的CD4+ T细胞进行蛋白质组学分析，鉴定差异表达线粒体蛋白，进行KEGG/GO富集分析，并验证ETC复合物表达和活性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫组化 | 抗ClpP抗体 | Abcam | ab126102 |
| 免疫印迹 | 抗β-actin抗体 | Proteintech | 66009-1-Ig |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| 免疫组化/免疫印迹 | 抗ZO-1抗体 | Abcam | ab221547 |
| 抗Claudin-1抗体 | Abcam | ab15098 | |
| 免疫印迹 | 抗Occludin抗体 | Abcam | ab216327 |
| 免疫组化/流式 | 抗CD4抗体 | ServiceBio | GB15064 |
| 免疫组化 | 抗CD69抗体 | Abcam | ab233396 |
| 抗CD86抗体 | ServiceBio | GB115630-100 | |
| 抗CD163抗体 | ServiceBio | GB13340 | |
| 抗Ki67抗体 | ServiceBio | GB121141 | |
| 免疫印迹 | 抗ATP5A抗体 | Abcam | ab176569 |
| 抗UQCRC2抗体 | Abcam | ab203832 | |
| 抗MTCO1抗体 | Abcam | ab203912 | |
| 抗SDHB抗体 | Abcam | ab175225 | |
| 抗NDUFB8抗体 | Abcam | ab192878 | |
| 抗p-STAT3抗体 | Abcam | ab30646 | |
| 抗RORγt抗体 | Abcam | ab207082 | |
| 流式细胞术 | FITC抗小鼠CD4抗体 | Elabscience | E-AB-F1097C |
| APC抗小鼠CD25抗体 | Elabscience | E-AB-F1102E | |
| PE FOXP3单克隆抗体 | eBioscience | 12-5773-82 | |
| Cyanine5.5抗小鼠CD4抗体 | Elabscience | E-AB-F1097J | |
| PE抗小鼠IL-17A抗体 | Elabscience | E-AB-F1199D | |
| FITC抗小鼠IFN-γ抗体 | Elabscience | E-AB-F1101C | |
| 免疫组化 | 抗CD11b抗体 | ServiceBio | GB11058 |
| 抗CD138抗体 | ServiceBio | GB115052-100 | |
| 免疫印迹 | 抗HK2抗体 | solarbio | K001797 |
| 抗LDHA抗体 | solarbio | K007244P | |
| 药物处理 | 托法替布 | MedChemExpress | HY-40354 |
| 结肠炎诱导 | 葡聚糖硫酸钠 | MP Biomedicals | 02160110-CF |
| 基因操作 | AAV8-shClpP | Sangon Biotech Corporation | -- |
| AAV8-ClpP | Sangon Biotech Corporation | -- | |
| 凋亡检测 | TUNEL染色试剂盒 | Beyotime | C1088 |
| ELISA | 小鼠IL-6 ELISA试剂盒 | Byotime | PI301 |
| 小鼠TNF-α ELISA试剂盒 | Byotime | PI326 | |
| 小鼠IL-1β ELISA试剂盒 | Byotime | PT512 | |
| ROS检测 | 活性氧检测试剂盒 | Solarbio | CA1410 |
| 凋亡检测 | Annexin V-FITC/碘化丙啶 | Solarbio | CA1020 |
| OCR检测 | Seahorse XF细胞线粒体压力测试试剂盒 | Agilent Technologies | 103015-100 |
| ETC复合物活性检测 | CheKine™线粒体复合物I活性比色测定试剂盒 | Abbkine, China | KTB1850 |
| CheKine™线粒体复合物III活性比色测定试剂盒 | Abbkine, China | KTB1870 | |
| CheKine™线粒体复合物IV活性比色测定试剂盒 | Abbkine, China | KTB1880 | |
| 16S rRNA基因测序 | 16S rRNA基因测序 | Rhonin Biosciences | -- |
| 蛋白质组学分析 | 线粒体蛋白质组学分析 | Bioprofile | -- |
| 实验动物 | C57BL/6JGpt/-Il10em1Cd4885/Gp小鼠 | GemPharmatech | T005959 |
| C57BL/6J小鼠 | Sichuan University | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| DSS结肠炎模型 | DSS浓度（2.5%）、给药方式（饮水或灌胃）、NCA029剂量（5, 10, 20 mg/kg）、对照组设置 阅读提示：STAR Methods中的“DSS colitis model” |
| IL-10 KO结肠炎模型 | 小鼠品系（C57BL/6JGpt/-Il10em1Cd4885/Gp）、年龄（6周龄）、NCA029剂量（20 mg/kg）、给药频率 阅读提示：STAR Methods中的“IL-10 KO colitis model” |
| CD4+ T细胞耗竭与回输 | 抗CD4单克隆抗体剂量（200 μg初始，100 μg维持）、回输细胞数（2×10^6）、回输时间（第4天）、NCA029剂量（20 mg/kg） 阅读提示：STAR Methods中的“Depletion and reinjection of CD4+ T cells” |
| AAV介导的ClpP敲低或过表达 | AAV8-shClpP和AAV8-ClpP的注射剂量（2×10^12病毒颗粒/100 μL盐水/小鼠）、注射时间（3周） 阅读提示：STAR Methods中的“Adeno-associated virus infection” |
| 体外CD4+ T细胞处理 | NCA029浓度（0.6 μM和9.6 μM用于IC50）、DSS刺激条件、OCR检测中的药物注射浓度（oligomycin 1.5 μM, FCCP 0.75 μM, rotenone/antimycin A 0.5 μM） 阅读提示：STAR Methods中的“Oxygen consumption rate (OCR) assay”和“Cell viability assay” |