临床样本检测
探究FGR胎盘中m6A修饰水平及METTL3表达是否异常
收集FGR患者和正常妊娠的胎盘绒毛组织，检测m6A水平、METTL3及m6A调节因子的表达。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
METTL3和IGF2BP2通过m6A修饰协同调控FOSL1 mRNA，抑制滋养层侵袭并导致胎儿生长受限
METTL3 and IGF2BP2 coordinately regulate FOSL1 mRNA via m6A modification, suppressing trophoblast invasion and contributing to fetal growth restriction.
实验完整度
高包含临床胎盘样本检测、细胞功能实验（增殖/侵袭/迁移）、MeRIP-seq和RNA-seq、RIP-qPCR及机制验证、体内FGR小鼠模型及药物干预等多个独立证据层级。
主要模型
HTR8/SVneo细胞 JAR细胞 ICR小鼠FGR模型（蛋白限制饮食） FGR患者胎盘绒毛组织
重点核对
FGR患者胎盘组织与正常对照组的样本量（n=27 vs n=23） METTL3过表达和敲低的HTR8/SVneo细胞系构建方法 STM2457体内给药剂量（25 mg/kg）及给药时间（E13.5-E17.5） FOSL1敲低实验所用siRNA序列及转染条件 MeRIP-seq和RNA-seq联合分析筛选FOSL1为靶基因的标准
摘要
胎儿生长受限（FGR）会增加短期和长期并发症的风险。mRNA上广泛的N6-甲基腺苷（m6A）修饰已被发现参与多种生物过程。然而，m6A修饰在FGR发病机制中的作用仍不清楚。在此，我们报告在FGR胎盘中检测到METTL3和m6A修饰水平升高。功能上，在HTR8/SVneo细胞中过表达METTL3后，细胞迁移、侵袭和增殖能力受到抑制。随后，我们联合使用METTL3敲低HTR8/SVneo细胞的甲基化RNA免疫沉淀测序（MeRIP-seq）和RNA测序（RNA-seq）来鉴定FOSL1为METTL3的下游靶基因。此外，我们证明了METTL3介导的m6A修饰以IGF2BP2依赖的方式增强FOSL1的表达。FOSL1抑制滋养层侵袭和迁移。重要的是，STM2457，一种新型METTL3催化抑制剂，被静脉注射到FGR小鼠模型中，在体内恢复了胎儿和胎盘的重量。在体外，STM2457以剂量依赖的方式调节滋养层增殖、侵袭和迁移。总之，本研究揭示了METTL3和IGF2BP2以m6A依赖的方式增加FOSL1的表达。FOSL1的增加破坏了正常的滋养层侵袭，从而导致FGR的进展。METTL3可作为FGR治疗的潜在靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- m6A修饰是否参与FGR的发病机制，以及METTL3和IGF2BP2如何通过m6A修饰调控FOSL1表达并影响滋养层功能？
- 核心机制
- METTL3介导的m6A修饰增强FOSL1 mRNA的稳定性，且依赖于m6A阅读蛋白IGF2BP2的结合，从而上调FOSL1表达，抑制滋养层侵袭和迁移，导致FGR进展。
- 主要证据
- FGR胎盘中METTL3和m6A水平升高；METTL3过表达降低滋养层细胞迁移和侵袭；MeRIP-seq和RNA-seq鉴定FOSL1为靶基因；RIP-qPCR证实METTL3和IGF2BP2结合FOSL1 mRNA；体内实验显示STM2457恢复FGR小鼠胎儿和胎盘重量。
- 研究意义
- 揭示了METTL3-IGF2BP2-FOSL1轴在FGR发病中的新机制，并提出METTL3可作为FGR治疗的潜在靶点，STM2457可能作为治疗药物。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细胞功能实验
验证METTL3对滋养层细胞增殖、侵袭和迁移的影响
在HTR8/SVneo和JAR细胞中过表达或敲低METTL3，检测细胞功能变化。
转录组和表观转录组分析
鉴定METTL3调控的m6A修饰靶基因
在METTL3敲低和对照HTR8/SVneo细胞中进行MeRIP-seq和RNA-seq，联合分析差异表达和m6A修饰基因。
靶基因验证
验证FOSL1是否为METTL3直接调控的下游靶基因
通过MeRIP-qPCR、RIP-qPCR和RNA稳定性实验验证METTL3对FOSL1的m6A修饰和调控。
功能验证
验证FOSL1对滋养层细胞功能的影响
通过siRNA敲低FOSL1，检测滋养层细胞侵袭和迁移能力的变化。
体内实验
评估METTL3抑制剂STM2457对FGR小鼠模型的治疗效果
建立蛋白限制饮食诱导的FGR小鼠模型，静脉注射STM2457，检测胎儿和胎盘重量及胎盘组织结构。
体外药物实验
探究STM2457对滋养层细胞功能及m6A修饰的影响
用不同浓度STM2457处理HTR8/SVneo细胞，检测METTL3表达、m6A水平、细胞活力、侵袭和凋亡。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| m6A水平检测 | EpiQuik m6A RNA甲基化定量试剂盒 | Epigentek | P-9005 |
| m6A dot blot | Hybond-N+ 膜 | LABSELECT | -- |
| m6A特异性抗体 | Abcam | ab286164 | |
| Western blot | METTL3抗体 | Abcam | ab195352 |
| FOSL1抗体 | Affinity | DF3096 | |
| 免疫荧光 | 细胞角蛋白7抗体 | ZSGB-BIO | ZM-0071 |
| FOSL1抗体 | Abcam | ab252421 | |
| RIP-qPCR | IGF2BP2抗体 | Abcam | ab128175 |
| 兔IgG | Proteintech | 14678-1-AP | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| Dynabeads mRNA纯化试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| RT-qPCR | 逆转录预混液 | MedChemExpress | -- |
| SYBR Green qPCR预混液 | Selleck | -- | |
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | PAN Biotech | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| 聚凝胺 | -- | -- | |
| 嘌呤霉素 | Beyotime | -- | |
| 细胞转染 | TransIntro EL转染试剂 | Transgen | -- |
| Opti-MEM培养基 | Gibco | -- | |
| Transwell实验 | 基质胶 | BD Biosciences | -- |
| 细胞培养小室 | Corning | -- | |
| 结晶紫 | -- | C0121 | |
| 细胞增殖 | EdU检测试剂盒 | RiboBIO | -- |
| CCK-8试剂 | MedChemExpress | -- | |
| 凋亡检测 | Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒 | Elabscience | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | -- | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| 免疫组化 | 免疫组化试剂盒 | ZSGB-BIO | -- |
| 染色 | 伊红 | Servicebio | -- |
| PAS染色液 | Servicebio | -- | |
| 测序 | Illumina Novaseq 6000测序平台 | LC-Bio Technology CO., Ltd. | -- |
| 组织处理 | RNA保存液 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 动物实验 | STM2457 | MedChemExpress | -- |
| PEG300 | MedChemExpress | -- | |
| 仪器 | BP-2000血压分析系统 | Visitech | -- |
| 微量分光光度计 | IMPLEN GmbH | -- | |
| 酶标仪 | TECAN | -- | |
| 化学发光成像系统 | Shenhua Science Technology | -- | |
| EVOS FL成像系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 显微镜 | Olympus | -- | |
| 流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| 测序 | 生物分析仪2100 | Agilent | -- |
| Dynabeads Oligo (dT)25磁珠 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 镁离子RNA片段化模块 | NEB | -- | |
| SuperScript II逆转录酶 | Invitrogen | -- | |
| 大肠杆菌DNA聚合酶I | NEB | -- | |
| RNase H | NEB | -- | |
| dUTP溶液 | Thermo Fisher Scientific | R0133 | |
| AMPureXP磁珠 | Beckman | -- | |
| 尿嘧啶DNA糖基化酶 | NEB | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床样本 | FGR诊断标准、样本排除标准、样本量（FGR=27，对照=23） 阅读提示：Materials and Methods - Sample collection |
| 细胞模型 | 细胞系来源、培养条件、METTL3过表达和敲低的慢病毒构建及感染复数 阅读提示：Materials and Methods - Cell culture and cell transfection |
| MeRIP-seq和RNA-seq | METTL3敲低实验组和对照组细胞、RNA提取和纯化方法、测序平台及分析流程 阅读提示：Materials and Methods - MeRIP-seq and RNA-seq |
| 体内药物实验 | FGR小鼠模型构建（低蛋白饮食8%）、STM2457剂量（25 mg/kg）及给药途径（静脉注射）、给药时间（E13.5-E17.5） 阅读提示：Materials and Methods - Experimental animals |
| 体外药物实验 | STM2457浓度（0.05-50 μM）、处理时间（48小时）、细胞活力检测方法 阅读提示：Materials and Methods - STM2457 treatment |