热灭活乳酸乳球菌菌株血浆通过上调IFN-α信号通路对人类登革热、基孔肯雅热和寨卡病毒的抗病毒作用

The Antiviral Effects of Heat-Killed Lactococcus lactis Strain Plasma Against Dengue, Chikungunya, and Zika Viruses in Humans by Upregulating the IFN-α Signaling Pathway.

作者信息Zhao Xuan Low, Osamu Kanauchi, Vunjia Tiong, Norhidayu Sahimin, Rafidah Lani, Ryohei Tsuji, Sazaly AbuBakar, Pouya Hassandarvish
PMID39597693
发布时间2024-11-13
DOI10.3390/microorganisms12112304

实验完整度

研究包括PBMC免疫调节检测、抗病毒实验及机制验证(IFNAR2阻断),但缺乏动物模型和患者样本,实验层级主要限于体外。

主要模型

健康人PBMCs Huh-7细胞 Vero细胞 DENV-2(NGC株)、CHIKV(ECSA基因型)、ZIKV(P6740株)

重点核对

PBMCs以2×10^5细胞/孔培养,并以10 μg/mL LC-Plasma刺激24小时 Huh-7细胞以1×10^5细胞/孔铺板,用10倍稀释的PBMC上清液(LCP Sup 1:10)刺激24小时,然后以MOI 0.1感染病毒1小时 抗IFNAR2抗体(3 μg/mL)预处理Huh-7细胞1小时以阻断I型干扰素信号 病毒滴度通过病灶或空斑实验测定,病毒RNA通过qRT-PCR定量 每个实验使用5个生物学重复(N=5),数据以中位数±SD表示

摘要

由于人口密集和生态破坏(如气候变化和人口流动性增加)导致病毒感染风险日益增加,这凸显了对登革热病毒(DENV)、基孔肯雅热病毒(CHIKV)和寨卡病毒(ZIKV)进行有效抗病毒治疗和预防措施的必要性。近年来,使用益生菌作为减少病毒感染的潜在抗病毒选择越来越受到关注。本研究旨在评估热灭活乳酸乳球菌菌株血浆(LC-Plasma)对外周血单个核细胞(PBMCs)的免疫调节作用及其对DENV、CHIKV和ZIKV的后续抗病毒反应。为评估LC-Plasma对健康个体分离的PBMCs的免疫调节作用,将PBMCs以2×10^5细胞/孔的密度培养,并用10微克/毫升的LC-Plasma刺激。LC-Plasma刺激的PBMCs表现出干扰素-α(IFN-α)产生升高,以及CD86和人类白细胞抗原-DR同种型(HLA-DR)上调,这可能与浆细胞样树突状细胞(pDC)活化有关。当用LC-Plasma刺激的PBMC上清液(LCP Sup)刺激Huh-7细胞时,DENV、CHIKV和ZIKV的复制呈剂量依赖性抑制。在LCP Sup刺激的Huh-7细胞中,干扰素刺激基因(ISG)的表达,包括ISG15、ISG20、IFITM-1、MxA和RSAD2,显著上调。本研究结果表明,LC-Plasma具有诱导IFN-α产生的潜力,导致ISG表达增强,并有助于广谱抗病毒反应。因此,LC-Plasma可作为改善病毒性疾病的合理辅助治疗,值得未来进行临床试验。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
LC-Plasma能否通过诱导IFN-α信号通路抑制DENV、CHIKV和ZIKV的复制?
核心机制
LC-Plasma激活PBMCs中的pDCs,上调HLA-DR和CD86,促进IFN-α产生,进而通过I型IFN信号通路(经IFNAR2)诱导Huh-7细胞ISG表达,从而产生广谱抗病毒效应。
主要证据
LC-Plasma刺激的PBMC上清液(LCP Sup 1:10)显著降低DENV、CHIKV和ZIKV感染性病毒滴度及RNA拷贝数(DENV有降低趋势但p=0.052),并上调Huh-7细胞中ISG15、ISG20、IFITM-1、MxA、RSAD2等ISG表达。阻断IFNAR2后,DENV RNA拷贝数显著增加(约27倍)。
研究意义
LC-Plasma可能作为预防病毒感染的辅助治疗手段,特别是针对热带地区流行的虫媒病毒,值得进一步体内研究和临床试验。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

PBMC分离、培养与LC-Plasma刺激

评估LC-Plasma对健康人PBMCs的免疫调节作用,包括IFN-α产生和pDC活化标志物表达。

从健康志愿者采集外周血,分离PBMCs,以2×10^5细胞/孔培养,用10 μg/mL LC-Plasma或1 μM CpG ODN 2216(阳性对照)刺激24小时,收集上清液(LCP Sup、CpG Sup)和非刺激对照上清(Neg Sup)。

2

IFN-α定量和pDC免疫表型分析

验证LC-Plasma刺激PBMCs后IFN-α分泌增加及pDC活化标志物表达上调。

通过ELISA定量PBMC上清液中IFN-α浓度;通过流式细胞术检测pDCs(CD123+CD304+)上CD86和HLA-DR表达。

3

抗病毒活性评估

评估LC-Plasma刺激的PBMC上清液对DENV、CHIKV和ZIKV复制的影响。

Huh-7细胞用LCP Sup(1:10稀释)或重组IFN-α(100单位)预处理24小时,然后以MOI 0.1感染病毒,48小时后收集上清液,通过qRT-PCR和病灶/空斑实验定量病毒滴度和RNA拷贝数。

4

ISG表达分析

验证LCP Sup刺激Huh-7细胞后干扰素刺激基因(ISG)表达上调。

Huh-7细胞用LCP Sup 1:10、CpG Sup 1:10、重组IFN-α(100单位)或Neg Sup 1:10刺激24小时,提取RNA逆转录,通过qRT-PCR检测ISG(IFITM-1、ISG15、ISG20、MxA、OAS-1、RSAD2、RyDEN)表达,以β-actin为参考基因。

5

I型IFN信号通路阻断实验

验证LC-Plasma抗病毒作用依赖于I型IFN信号通路。

Huh-7细胞用抗IFNAR2抗体(3 μg/mL)或小鼠IgG2a同型对照预处理1小时,然后加入LCP Sup 1:10刺激24小时,随后感染DENV,48小时后通过qRT-PCR定量病毒RNA。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

PBMC分离与培养
细胞培养
病毒扩增与滴定
细胞因子定量
免疫表型分析
基因表达分析

产品清单

实验环节名称品牌货号
BD Vacutainer CPT玻璃分子诊断管BD--
Cellbanker2ZENOGEN--
RPMI-1640培养基Corning--
杜尔贝科改良伊格尔培养基Corning--
胎牛血清Gibco--
青霉素/链霉素Gibco--
L-谷氨酰胺Gibco--
台盼蓝Bio-rad--
TC20自动细胞计数器Bio-rad--
羧甲基纤维素Sigma Aldrich--
Triton X-100Sigma-Aldrich--
脱脂奶粉Thermo Fisher--
HRP标记的兔抗人IgG(H+L)二抗Invitrogen--
TrueBlue过氧化物酶底物Seracare--
CpG ODN 2216Invivogen--
人IFN-α ELISA试剂盒ElabscienceE-EL-H6125
酶标仪Tecaninfinite 200 Pro
抗人CD304/B515抗体BD--
CD86/PE抗体BD--
HLA-DR/PE-CyTM抗体BD--
CD123/APC抗体BD--
7AAD细胞活性染料BD--
染色缓冲液BD--
BD FACScanto II流式细胞仪BD--
重组通用I型IFN-αPBL assay science--
抗IFNAR2抗体(克隆MMHAR-2)PBL Assay Science--
小鼠IgG2a同型对照Invitrogen--
QIAampR病毒RNA提取试剂盒QIAGENQIAG-52904
SensiFast SYBER Hi-ROX一步法试剂盒BiolineBIO-73005
RNeasy试剂盒QiagenQIAG-74106
iScript cDNA合成试剂盒BioRad1708891
Luna®通用qRT-PCR预混液NEBM3003L
QuantStudio™ 5实时荧光定量PCR系统Thermo Fisher--
Omni-Ruptor 4000超声匀浆器OMNI international--
GraphPad Prism 9.0----
EZR软件----

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
PBMC分离与刺激
PBMC的分离方法(CPT管)、冻存液、密度(2×10^5细胞/孔)、LC-Plasma浓度(10 μg/mL)、刺激时间(24小时)
阅读提示:方法2.2和2.7节
IFN-α定量
ELISA试剂盒(Elabscience)、标准曲线、样本稀释倍数
阅读提示:方法2.8节
流式细胞术
抗体克隆号、染色浓度、pDCs门控策略(CD123+CD304+)、最少事件数(150个)
阅读提示:方法2.9节
抗病毒实验
Huh-7细胞密度(1×10^5/孔)、LCP Sup稀释度(1:10)、感染MOI(0.1)、感染时间(1小时)、收获时间(48小时)
阅读提示:方法2.10节
病毒滴定
Vero细胞密度(1×10^5/孔)、病毒吸附时间(1小时)、覆盖物(0.9% CMC)、固定和染色方法
阅读提示:方法2.5节
ISG表达分析
刺激浓度(LCP Sup 1:10)、刺激时间(24小时)、使用基因(RyDEN、IFITM-1、OAS-1、ISG15、ISG20、RSAD2、MxA)及内参(ACTB)
阅读提示:方法2.12节
IFNAR2阻断实验
抗体浓度(3 μg/mL)、预处理时间(1小时)、LCP Sup浓度(1:10)、病毒株及MOI(0.1)
阅读提示:方法2.10节