PBMC分离、培养与LC-Plasma刺激
评估LC-Plasma对健康人PBMCs的免疫调节作用,包括IFN-α产生和pDC活化标志物表达。
从健康志愿者采集外周血,分离PBMCs,以2×10^5细胞/孔培养,用10 μg/mL LC-Plasma或1 μM CpG ODN 2216(阳性对照)刺激24小时,收集上清液(LCP Sup、CpG Sup)和非刺激对照上清(Neg Sup)。
The Antiviral Effects of Heat-Killed Lactococcus lactis Strain Plasma Against Dengue, Chikungunya, and Zika Viruses in Humans by Upregulating the IFN-α Signaling Pathway.
研究包括PBMC免疫调节检测、抗病毒实验及机制验证(IFNAR2阻断),但缺乏动物模型和患者样本,实验层级主要限于体外。
健康人PBMCs Huh-7细胞 Vero细胞 DENV-2(NGC株)、CHIKV(ECSA基因型)、ZIKV(P6740株)
PBMCs以2×10^5细胞/孔培养,并以10 μg/mL LC-Plasma刺激24小时 Huh-7细胞以1×10^5细胞/孔铺板,用10倍稀释的PBMC上清液(LCP Sup 1:10)刺激24小时,然后以MOI 0.1感染病毒1小时 抗IFNAR2抗体(3 μg/mL)预处理Huh-7细胞1小时以阻断I型干扰素信号 病毒滴度通过病灶或空斑实验测定,病毒RNA通过qRT-PCR定量 每个实验使用5个生物学重复(N=5),数据以中位数±SD表示
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估LC-Plasma对健康人PBMCs的免疫调节作用,包括IFN-α产生和pDC活化标志物表达。
从健康志愿者采集外周血,分离PBMCs,以2×10^5细胞/孔培养,用10 μg/mL LC-Plasma或1 μM CpG ODN 2216(阳性对照)刺激24小时,收集上清液(LCP Sup、CpG Sup)和非刺激对照上清(Neg Sup)。
验证LC-Plasma刺激PBMCs后IFN-α分泌增加及pDC活化标志物表达上调。
通过ELISA定量PBMC上清液中IFN-α浓度;通过流式细胞术检测pDCs(CD123+CD304+)上CD86和HLA-DR表达。
评估LC-Plasma刺激的PBMC上清液对DENV、CHIKV和ZIKV复制的影响。
Huh-7细胞用LCP Sup(1:10稀释)或重组IFN-α(100单位)预处理24小时,然后以MOI 0.1感染病毒,48小时后收集上清液,通过qRT-PCR和病灶/空斑实验定量病毒滴度和RNA拷贝数。
验证LCP Sup刺激Huh-7细胞后干扰素刺激基因(ISG)表达上调。
Huh-7细胞用LCP Sup 1:10、CpG Sup 1:10、重组IFN-α(100单位)或Neg Sup 1:10刺激24小时,提取RNA逆转录,通过qRT-PCR检测ISG(IFITM-1、ISG15、ISG20、MxA、OAS-1、RSAD2、RyDEN)表达,以β-actin为参考基因。
验证LC-Plasma抗病毒作用依赖于I型IFN信号通路。
Huh-7细胞用抗IFNAR2抗体(3 μg/mL)或小鼠IgG2a同型对照预处理1小时,然后加入LCP Sup 1:10刺激24小时,随后感染DENV,48小时后通过qRT-PCR定量病毒RNA。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| PBMC分离 | BD Vacutainer CPT玻璃分子诊断管 | BD | -- |
| PBMC冻存 | Cellbanker2 | ZENOGEN | -- |
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Corning | -- |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基 | Corning | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | -- | |
| L-谷氨酰胺 | Gibco | -- | |
| 细胞活力检测 | 台盼蓝 | Bio-rad | -- |
| 细胞计数 | TC20自动细胞计数器 | Bio-rad | -- |
| 病毒滴定 | 羧甲基纤维素 | Sigma Aldrich | -- |
| 通透化 | Triton X-100 | Sigma-Aldrich | -- |
| 病毒滴定 | 脱脂奶粉 | Thermo Fisher | -- |
| HRP标记的兔抗人IgG(H+L)二抗 | Invitrogen | -- | |
| TrueBlue过氧化物酶底物 | Seracare | -- | |
| PBMC刺激 | CpG ODN 2216 | Invivogen | -- |
| IFN-α定量 | 人IFN-α ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-H6125 |
| 酶标仪 | Tecan | infinite 200 Pro | |
| 流式细胞术 | 抗人CD304/B515抗体 | BD | -- |
| CD86/PE抗体 | BD | -- | |
| HLA-DR/PE-CyTM抗体 | BD | -- | |
| CD123/APC抗体 | BD | -- | |
| 7AAD细胞活性染料 | BD | -- | |
| 染色缓冲液 | BD | -- | |
| BD FACScanto II流式细胞仪 | BD | -- | |
| 抗病毒实验 | 重组通用I型IFN-α | PBL assay science | -- |
| 抗IFNAR2抗体(克隆MMHAR-2) | PBL Assay Science | -- | |
| 小鼠IgG2a同型对照 | Invitrogen | -- | |
| RNA提取 | QIAampR病毒RNA提取试剂盒 | QIAGEN | QIAG-52904 |
| qRT-PCR | SensiFast SYBER Hi-ROX一步法试剂盒 | Bioline | BIO-73005 |
| 基因表达 | RNeasy试剂盒 | Qiagen | QIAG-74106 |
| iScript cDNA合成试剂盒 | BioRad | 1708891 | |
| Luna®通用qRT-PCR预混液 | NEB | M3003L | |
| QuantStudio™ 5实时荧光定量PCR系统 | Thermo Fisher | -- | |
| LC-Plasma制备 | Omni-Ruptor 4000超声匀浆器 | OMNI international | -- |
| 数据分析 | GraphPad Prism 9.0 | -- | -- |
| 统计分析 | EZR软件 | -- | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| PBMC分离与刺激 | PBMC的分离方法(CPT管)、冻存液、密度(2×10^5细胞/孔)、LC-Plasma浓度(10 μg/mL)、刺激时间(24小时) 阅读提示:方法2.2和2.7节 |
| IFN-α定量 | ELISA试剂盒(Elabscience)、标准曲线、样本稀释倍数 阅读提示:方法2.8节 |
| 流式细胞术 | 抗体克隆号、染色浓度、pDCs门控策略(CD123+CD304+)、最少事件数(150个) 阅读提示:方法2.9节 |
| 抗病毒实验 | Huh-7细胞密度(1×10^5/孔)、LCP Sup稀释度(1:10)、感染MOI(0.1)、感染时间(1小时)、收获时间(48小时) 阅读提示:方法2.10节 |
| 病毒滴定 | Vero细胞密度(1×10^5/孔)、病毒吸附时间(1小时)、覆盖物(0.9% CMC)、固定和染色方法 阅读提示:方法2.5节 |
| ISG表达分析 | 刺激浓度(LCP Sup 1:10)、刺激时间(24小时)、使用基因(RyDEN、IFITM-1、OAS-1、ISG15、ISG20、RSAD2、MxA)及内参(ACTB) 阅读提示:方法2.12节 |
| IFNAR2阻断实验 | 抗体浓度(3 μg/mL)、预处理时间(1小时)、LCP Sup浓度(1:10)、病毒株及MOI(0.1) 阅读提示:方法2.10节 |