体内攻毒实验评估ASFV对凝血的影响
检测ASFV感染对猪体内凝血因子表达和活性的影响。
对6头SPF猪肌内注射102.5 HAD50的ASFV HLJ/18，在0、3、5、7天采血检测F10、F2、D2D表达和F10活性。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
TRIM28调控非洲猪瘟病毒p72抑制的凝血级联反应
TRIM28 regulates the coagulation cascade inhibited by p72 of African swine fever virus.
实验完整度
高包含体内猪攻毒实验、体外细胞感染、siRNA干扰、免疫共沉淀、下拉实验、质谱分析及荧光定位等，明确功能与机制验证。
主要模型
猪（SPF猪 ASFV HLJ/18攻毒模型） 猪肺泡巨噬细胞（PAM） Huh7细胞 293-T细胞
重点核对
ASFV株：GZ201801（体外）、HLJ/18（体内），基因型II PAM感染MOI：0.1，时间点：6、12、24、36 hpi 猪攻毒剂量：102.5 HAD50，途径：肌内注射 siRNA浓度：1 μg（PAM），10、50、75 nM（Huh7） MG132浓度：10、50、100 nM
摘要
2018年，非洲猪瘟病毒（ASFV）在中国出现，对国内养猪业造成了极其严重的经济损失。感染ASFV可引起播散性凝血，导致血小板和凝血因子消耗及严重出血。然而，病毒诱导凝血的机制尚未明确。在本研究中，通过检测ASFV HLJ/18攻毒猪的D-二聚体（D2D）和因子X（F10）表达，发现ASFV下调凝血过程。在体外，ASFV感染猪肺泡巨噬细胞（PAMs）后，因子IX（F9）和因子XII（F12）表达升高，而F10表达下调。非洲猪瘟病毒同时诱导内源性和外源性凝血级联反应。此外，若干编码蛋白影响关键凝血蛋白F10的表达，其中p72抑制F10的活性和表达。蛋白质组学分析也显示p72参与凝血级联反应。p72可与F10相互作用，其抑制功能域包括氨基酸423–432和443–452。最后，我们发现F10和p72与含三结构域蛋白28（TRIM28）相互作用。敲低TRIM28导致F10表达降低。重要的是，TRIM28有助于p72调控的F10蛋白表达降低。我们的发现揭示了病毒蛋白p72对ASFV感染诱导的凝血级联反应的抑制作用，并揭示了TRIM28在降低F10表达中的作用，从而揭示了ASFV相关凝血的分子机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- ASFV感染如何调控凝血级联反应，及其分子机制。
- 核心机制
- ASFV编码蛋白p72与凝血因子F10相互作用，并通过泛素-蛋白酶体途径促进F10降解，TRIM28作为E3连接酶参与该过程。
- 主要证据
- 体内猪攻毒显示F10和D2D表达降低；体外PAM感染显示F10下调；p72过表达抑制F10表达和活性，免疫共沉淀和下拉实验证实p72与F10互作，TRIM28敲低减弱p72对F10的抑制作用。
- 研究意义
- 首次揭示ASFV及其编码蛋白通过降低F10表达调控凝血过程，以及TRIM28在p72介导的F10降解中的重要作用，为ASFV相关凝血机制提供新见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外感染实验验证ASFV对凝血因子的调控
检测ASFV感染对PAM细胞中凝血因子表达的影响。
PAM细胞以0.1 MOI感染ASFV，在6、12、24、36小时收集细胞，Western blot检测F9、F12、F10、TF、F7。
siRNA筛选凝血因子对F10表达的调控
确定ASFV感染影响F10表达所涉及的凝血通路（内源性或外源性）。
将F1-F12的siRNA转染PAM细胞后感染ASFV，检测F10表达变化。
筛选ASFV编码蛋白对F10的调控
鉴定影响F10表达的ASFV编码蛋白。
在Huh7细胞中过表达p54、O61R、K205R、p30、EP153R、I177L、E199L、B438L、p72等蛋白，检测F10表达和活性。
p72与F10相互作用验证
验证p72与F10的物理相互作用。
通过免疫共沉淀、His-pull-down和共聚焦显微镜检测p72与F10的互作。
确定p72抑制F10的功能域
定位p72中抑制F10表达所需的功能区域。
构建p72截短体和突变体，转染Huh7细胞检测F10表达和活性。
TRIM28在p72介导F10降解中的作用
研究TRIM28是否参与p72对F10表达的抑制。
通过siRNA敲低TRIM28，检测p72对F10表达的影响；用MG132抑制蛋白酶体观察F10降解变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证机制链路
评估体内效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Thermo Scientific | -- |
| DMEM培养基 | Thermo Fisher | -- | |
| 抗体 | 抗F10一抗 | Beyotime | AF6831 |
| 抗HA抗体 | Proteintech | 51064-2-AP | |
| 抗TRIM28抗体 | Proteintech | 15202-1-AP | |
| 抗F12抗体 | Proteintech | 12551-1-AP | |
| 抗F9抗体 | Proteintech | 21481-1-AP | |
| 抗F11抗体 | Sino Biological | 10302-RP01 | |
| ELISA | 猪凝血因子F10 ELISA试剂盒 | Cusabio | -- |
| 猪凝血因子II ELISA试剂盒 | Cusabio | -- | |
| D-二聚体ELISA试剂盒 | Cusabio | -- | |
| 药物处理 | MG132 | Selleck | S2619 |
| qPCR | SYBR Green qPCR预混液 | Vazyme | -- |
| 转染 | Rfect siRNA转染试剂 | BAIDAI | -- |
| 纯化 | Ni+纯化树脂 | -- | -- |
| 免疫沉淀 | A/G Plus琼脂糖珠 | -- | -- |
| Western blot | 增强化学发光系统 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 质谱 | Q Exactive HF质谱仪 | Thermo Scientific | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体内攻毒实验 | 猪的品种、年龄、体重、SPF状态、攻毒剂量HAD50、攻毒途径、检测时间点 阅读提示：见‘Animal experiments’部分及图注Figure 1 |
| 细胞感染 | PAM细胞来源、MOI、感染时间点 阅读提示：见‘Viruses and cell culture’及‘In vitro study’部分 |
| siRNA干扰 | siRNA序列、转染浓度、转染时间、检测时间 阅读提示：见‘siRNA’部分及表1 |
| p72功能域鉴定 | 截短体/突变体构建、转染量、检测时间、ELISA和Western blot条件 阅读提示：见‘Results’中‘The N-terminal 423-450aa…’部分及图6图注 |
| 蛋白互作验证 | 转染质粒、抗体、细胞系、免疫沉淀条件 阅读提示：见‘Immunoprecipitation’、‘Pull-down assay’及结果中‘p72 interacted with…’部分 |
| TRIM28功能研究 | siTRIM28浓度、MG132浓度、处理时间、检测方法 阅读提示：见‘Effect of the MG132 inhibitor…’、‘Effect of siTRIM28…’及图8图注 |